贵州省余庆县茶褐枯病病原菌的鉴定

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　　摘要 为鉴定引起茶褐枯病的病原菌，本研究对病原菌进行分离、纯化和培养，通过柯赫氏法则验证菌株的致病性，并观察病原菌的形态特征，依据病原菌rDNA-ITS、ACT、CAL 和TUB2基因进行多基因系统发育分析。结果显示：病原菌分生孢子呈淡蓝色，表面光滑，无隔膜，圆柱状，两端钝或向底部变窄，水滴状斑点，大小为（11.7～29.5）μm×（3.9～7.7）μm，平均为（19.4±4.4）μm×（5.4±0.8）μm，分生孢子梗形成于气生菌丝上，透明，具有隔膜;附着胞为棒状等不规则形状，颜色呈棕色到深棕色，单生。基于病原菌形态学鉴定和多基因系统发育分析结果，将病原菌确定为山茶刺盘孢Colletotrichum camelliae。
　　关键词 茶褐枯病; 山茶刺盘孢; 形态特征; 致病性分析; 系统发育分析
　　中图分类号： S 435.711  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019225
　　Abstract To identify the pathogen causing tea brown blight disease， we isolated， purified and cultivated the pathogenic fungus from the diseased tea leaves. Its pathogenicity was determined according to Koch’s rule， and the morphological characteristics of the pathogen were observed. Phylogenetic analysis of multi-locus sequences， including rDNA-ITS， actin， calmodulin and tubulin 2， was conducted. The results showed that the conidium of the pathogen was hyaline， smooth-walled， aseptate， cylindrical， with obtuse ends or narrowed towards the base， guttulate， （11.7-29.5）μm×（ 3.9-7.7）μm， and the average was （19.4±4.4）μm×（5.4±0.8）μm. Conidiophores were directly formed from aerial mycelia， hyaline， septate. Appressoria were clavate， irregularly shaped， brown to dark brown， and solitary. Based on phylogenetic analyses and morphology， the pathogen was identified as Colletotrichum camelliae.
　　Key words tea brown blight disease; Colletotrichum camelliae; morphological characteristics; pathogenicity analysis; phylogenetic analysis
　　 茶树是多年生灌木或乔木，广泛种植于热带、亚热带和温带地区。茶树病害种类较多，对茶叶的產量和品质构成一定的影响[1-3]。据报道，世界上已有记载的茶树病原种类多达500余种，我国已记载的茶树病害种类有138种[2]。根据病害在茶树上的发生部位，将其分为叶部病害、茎部病害、根部病害和花部病害。其中，茶树叶部病害的种类相对其他部位的种类多[2]。同时，研究发现，同一种病原菌可侵染茶树不同的组织部位，引起不同的组织产生病害[4-7]。此外，多种病原菌可复合侵染引起茶树病害[8]。2016年至今，陆续有茶树新病害和新病原的报道，例如，拟盘多毛孢Pestalotiopsis camelliae所引起的茶轮斑病[9]，茶拟盘多毛孢P. theae引起的黑褐色叶斑病[10]，茎点霉属病原菌Phoma segeticola var. camelliae和P. herbarum所引起的茶叶斑病[11-12]，果生刺盘孢Colletotrichum fructicola 所引起的茶炭疽病[13]。茶褐枯病（tea brown blight disease）是由病原真菌所引起的茶树叶部病害，该病害在中国、日本、斯里兰卡、印度等产茶国家均有报道[14-18]。病害发生初期，病斑呈深褐色，圆形;后期病斑逐渐扩大形成不规则病斑，中央出现凸起的黑色块状物质，四周褪色，边界清晰[14]。发生茶褐枯病的茶树树势衰退，茶树抽发的新梢、新芽较少，茶叶产量显著降低[14]。引起茶褐枯病的病原菌有多种，例如，山茶刺盘孢C.camelliae[19-20]、围小丛壳菌山茶专化型Glomerella cingulata f.sp. camelliae和葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea可通过复合侵染引起茶褐枯病[8]等。此外，文献报道C.acutatum的复合体和C.gloeosporioides的复合体也可导致茶褐枯病[14-15， 19]。山茶刺盘孢是最早被鉴定为茶褐枯病的病原菌[20]。同时，山茶刺盘孢也是茶炭疽病的病原菌之一[21]。因培养条件的不同，山茶刺盘孢在菌落形态、孢子大小、长宽比等方面存在一定的差异[7， 19， 21-22]。采用多基因系统发育树的方法是鉴定山茶刺盘孢的主要依据，例如，rDNA-ITS、TUB2、ACT和CAL基因[20]。
　　贵州省是我国最大的茶叶产区，截至2017年底，全省投产茶园面积稳定在35万hm2 以上[23]。由于贵州茶区存在多云雾、寡日照、早春低温阴雨等气候特征，茶树病害的发生率、危害度较其他茶区严重，成为限制贵州省茶产叶产量和质量的重要因素[11， 23-25]。2016年5-8月，本课题组在贵州省余庆县二龙茶区进行田间调查，发现一种茶树叶部病害，个别茶园病害发生率达35%至48%，病害严重度在32%至43%，其病害特征与茶褐枯病症状相似（图1）。为了明确该病的病原菌，本文对该病害的病原菌进行分离、纯化、形态学观察、多基因系统发育树分析，以及致病性试验，确定引起该地区茶树叶部病害的病原为山茶刺盘孢。本研究为该病害的防控提供了重要的数据参考。 　　1 材料与方法
　　1.1 病原菌分离、培养和纯化
　　2016年5月-8月，在贵州省余庆县二龙茶区采集具有典型茶褐枯病症状的茶树叶片，参照本课题组前期研究方法，将分离好的组织叶片置于25℃培养箱中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose ager，PDA）上[11， 24]。培养3～4 d后挑取边缘菌丝进行纯化，得到3个形态相似的代表性菌株，将其保存于本实验室的农作物病害标本室。
　　1.2 形态学观察
　　将菌株接种到PDA培养基上，置于25℃培养箱中7 d，挑取PDA培养基上少许菌丝制片，采用光学显微镜（Olympus， BX43和FVMPE-RS）和扫描电镜（Hitachi， S-3400N）观察病原菌的菌落、菌丝、分生孢子梗、分生孢子及附着胞的形态特征，并记录大小。
　　1.3 致病性测试
　　挑取在PDA培养基中培养5 d后的菌碟（d=4 mm）接种至经针刺和剪切处理后的茶叶片、茎及花上，采用湿润的无菌脱脂棉进行48 h保湿[11， 24， 26]。套上保鲜袋，置于25℃人工气候箱中进行恒温培养。同时接种无菌PDA的叶片、莖及茶花作为空白对照。48 h后取下脱脂棉及菌碟，并定期观察及记录症状变化。每个处理方式均15个重复。对发病部位进行再分离，确定其与接种菌株是否一致。上述试验独立重复3次。
　　1.4 分子鉴定
　　根据Weir等[20]报道的引物，对核糖体内转录区（rDNA-ITS）、肌动蛋白（ACT）、钙调蛋白（CAL）、微管蛋白（TUB2）基因进行扩增及测序，其中，CAL采用CL1和CL2A引物进行扩增，TUB2 采用T1和Bt-2b引物进行扩增。基因序列采用NCBI-BLAST在线比对，其结果用以确定属级分类地位。测序结果上传GenBank获取登录号，并下载相关的参比序列。采用PAUP v 4.0b10（Swofford 2003）及最大简约法（maximum parsimony， MP）进行聚类分析及进化树构建，rDNA-ITS、TUB2、ACT和CAL基因的系统发育树分析方法选择Bootstrap，重复次数（replication）为1 000，最大的树数目（maxtree）设置为5 000。小于50的自展值在发育树上不体现。
　　1.5 数据分析
　　数据采用SPSS 11.5软件进行统计分析。采用ANOVA （LSD）对各组间的数据进行方差分析。统计学差异采用顺序字母标注法进行标注。
　　2 结果与分析
　　2.1 病原菌的分离与纯化
　　从有典型茶褐枯病症状的茶树叶片分离纯化出15个菌株，其中山茶刺盘孢 C.camelliae菌株最多，共10个，比例约为66.7%，同时也分离到枝状枝孢Cladosporium cladosporioides、荸荠茎点霉秆枯病菌Didymella bellidis、双乳突炭层菌Nemania bipapillata和棕榈拟盘多毛孢Pestalotiopsis trachicarpicola等菌株。选择GZYQ-2016-01 等3个代表性菌株进行深入研究。
　　2.2 病原菌形态学鉴定
　　GZYQ-2016-01菌株在PDA培养基上为白色菌丝，边缘气生状，中间绒毛状，边缘平整。培养8 d后，菌落中央颜色加深，变为灰褐色。观察发现，分生孢子梗形成于气生菌丝上，透明，具有隔膜（图2a～c）;分生孢子梗顶端产生分生孢子，随着分生孢子的成熟和变大，分生孢子与分生孢子梗分离（图2c），并在分生孢子梗末端形成断面和缺口（图中箭头所示）（图2d～e）。镜下未观察到厚垣孢子、产孢细胞及有性型。孢子呈淡蓝色，表面光滑，无隔膜，圆柱状，两端钝或向底部变窄，水滴状斑点，大小为（11.7～29.5）μm×（3.9～7.7）μm，平均为（19.4±4.4）μm×（5.4±0.8）μm，长宽比=3.6，n=50，镜下未观察到刚毛（图3a～b）。附着胞为棒状等不规则形状，颜色呈棕色到深棕色，单生，大小为（11.9～25.1）μm×（5.6～16.4）μm，平均为（15.6±2.4）μm×（10.0±2.7）μm，长宽比=1.56，n=50（图中箭头所示）（图3c～d）。
　　
　　2.3 病原菌的致病性测定
　　茶树叶片采用剪切法和针刺法，嫩茎采用剪切法，茶花花瓣采用针刺法接种无菌PDA或菌株GZYQ-2016-01，并定时观察和记录症状。接种无菌PDA未导致叶、茎和花产生病斑（图4a～d）。接种病原菌至叶、茎和花2 d后，均可见较为明显的病斑，其中，叶片伤口处呈褐色，边缘为黑色。当时间延长至10 d，2种处理的叶部病斑都不断扩大（图4e～f）。接种病原菌10 d后，茎部病斑不断扩大，呈黑褐色（图4g），上位叶萎蔫（图片未显示）。接种病原菌4 d，花瓣接种处变为灰褐色，花瓣萎蔫（图4h）。其中，叶部症状与田间症状相似。进一步对病斑中的病原菌进行分离培养及分子鉴定，结果表明与接种菌一致。进一步对茶叶针刺和剪切处理10 d的发病率和病斑大小进行统计，表明剪切处理的侵染率与针刺处理相同（P<0.05），并且2种处理在接种后期的病斑大小差异不明显（P<0.05）（表1）。
　　
　　2.4 病原菌分子生物学鉴定
　　在获得菌株GZYQ-2016-01的rDNA-ITS（MK058490）、CAL（MK078541）、TUB2 （MK192296）、ACT（MK078543）等基因登录号后，序列比对发现菌株GZYQ-2016-01与C.camellia的模式菌株（LF152）的4个基因序列相似性非常高。我们采用4个基因（rDNA-ITS+TUB2+CAL+ACT）加合的方法进行系统学分析。4个基因加合总长度为2 305个位点（ACT：1-282， rDNA-ITS： 283-876， TUB2： 877-1 571， CAL： 1 572-2 305）。其中，简约信息位点20个，可变非简约信息位点72个，并采用PAUP v 4.0b10（Swofford 2003）软件构建进化树。运行结果显示获得1个进化树（TL=105， CI=0.93， RI=0.85， RC=0.80， HI=0.07）（图5）。系统学的分析将GZYQ-2016-01与模式菌株C.camelliae LF152归为一个分支（自举支持率为96%）。 　　3 讨论
　　本研究从贵州省余庆县茶褐枯病的病害样品中分离获得与菌株GZYQ-2016-01 高度相似的3个菌株，根据柯赫氏法则，确认其为茶褐枯病的致病菌。基于形态学特征和4个基因序列所构建的系统发育树初步确定菌株GZYQ-2016-01等为山茶刺盘孢。
　　当前，山茶刺盘孢的分类主要依据于形态学结合多基因系统发育树的方法[27]。C.camelliae 或G. cingulata f.sp. camelliae的病原形态学研究表明，该菌的菌落形态等受培养条件、寄主等因素影响而存在一定差异。例如，G. cingulata f.sp. camelliae的菌株ICMP18542、ICMP10643、ICMP10646，以及C.camelliae CGMCC 3.14925在PDA培养基上的菌落形态和生长速率有着一定的差异[19， 22]。本研究发现菌株GZYQ-2016-01在PDA上的菌落形态与G. cingulata f.sp. camelliae ICMP18542的菌落形态相似。通过比较C.camelliae 或G. cingulata f.sp. camelliae菌株在PDA、TWA或SNA培養基上产孢细胞、分生孢子梗、分生孢子或附着胞等形态，发现它们的分生孢子和产孢细胞在大小或形状上存在一定差异。例如，G. cingulata f.sp. camelliae的分生孢子在PDA上的长度大于TWA上的长度，但宽度要小[7]。本研究发现菌株GZYQ-2016-01的分生孢子大小为（11.7～29.5）μm×3.9～7.7 μm，平均为（19.4±4.4）μm×（5.5±0.8）μm，长宽比=3.6，比C.camelliae Massee长宽比大。同时，中国江苏分离物C.camelliae JS1A35的长宽比=2.5，中国云南分离物YN2A1的长宽比=3.1。表明本研究所分离的C.camelliae GZYQ-2016-01在分生孢子形态上与文献具有一定差异[21]。菌株GZYQ-2016-01产生分生孢子梗，与C.camelliae JS1A35的分生孢子梗形状相似。此外，附着胞的形态也存在一定的差异[19]。
　　由于山茶刺盘孢在微观形态上存在多样性，给病原的诊断带来困难。Liu等采用ACT、CAL、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）、rDNA-ITS和TUB2进行多基因系统发育树分析[19]。Wang等为了区别炭疽种类和胶孢炭疽的复合体，则采用 rDNA-ITS、ACT、GAPDH、CAL、几丁质合成酶（CHS-1）、TUB2和GS基因进行多基因系统发育树分析[21]。而本研究对文献所涉及的基因进行扩增和测序，综合现有模式菌株的基因序列等信息，选择了rDNA-ITS、TUB2、CAL和ACT 4个基因进行系统发育树的构建，结果表明菌株GZYQ-2016-01与C.camelliae LF152自举支持率为96%，表明菌株GZYQ-2016-01为C.camelliae。本研究发现菌株GZYQ-2016-01在致病性上与Dickens等报道有相似之处[7]，菌株GZYQ-2016-01和G. cingulata f.sp. camelliae isolate 82437均可导致叶和茎部产生病斑，同时，病原只能通过损伤方式入侵，无损方式不能产生病症。Wang等[21]认为C.camelliae为中国茶树炭疽菌的优势种，同时Liu等[19]认为C.camelliae也是茶褐枯病的病原菌，因此，我们认为同种病原菌会引起茶树产生不同的病害症状，其主要原因可能是与茶树的抗性品种、病害发生的地理、气候、茶园微生态种群结构等因素相关。因此，结合分子生物学鉴定结果及形态学特征，我们确定贵州省余庆县茶区茶褐枯病的病原菌GZYQ-2016-01等为C.camelliae。
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　　（责任编辑： 田 喆）
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