osa-miR168a-5p靶向调节人源ADD1及E2F2基因表达的研究

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　　摘要：目的  探究植物osa-miR168a-5p靶向调节人源相关基因表达的影响。方法  采用TargetScan预测osa-miR168a-5p的靶基因，并筛选相关靶基因进行后续验证。构建靶基因mRNA 3'-UTR荧光素报告基因及相应的突变体，采用双荧光素酶报告基因活性分析系统验证osa-miR168a-5p与靶基因的关系。结果  利用Targetscan预测的osa-miR168a-5p靶基因结果显示，ADD1与E2F2mRNA3'-UTR区域均存在osa-miR168a-5p结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，使用osa-miR168a-5p mimics内源性增加osa-miR168a-5p能够抑制ADD1及E2F2报告基因的表达，将ADD1及E2F2 mRNA 3'UTR区与osa-miR-168a-5p的结合位点突变后，内源性osa-miR-168a-5p增加所引起的报告基因表达下调的作用消失。结论  osa-miR168a-5p能够直接调节人源ADD1及E2F2基因表达，因此食物中的osa-miR168a进入人体很可能直接靶向人源ADD1及E2F2基因发挥相应的生物学效应。
　　关键词：osa-miR168a;ADD1;E2F2;靶基因
　　中图分类号：R3                                      文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.020
　　文章编号：1006-1959（2020）11-0064-03
　　Abstract：Objective  To explore the effect of plant osa-miR168a-5p on targeted regulation of human-related gene expression.Methods  TargetScan was used to predict osa-miR168a-5p target genes， and related target genes were screened for subsequent verification. The target gene mRNA 3'-UTR luciferin reporter gene and corresponding mutants were constructed， and the dual luciferase reporter gene activity analysis system was used to verify the relationship between osa-miR168a-5p and the target gene.Results  The results of osa-miR168a-5p target genes predicted by Targetscan showed that both ADD1 and E2F2mRNA 3'-UTR regions had osa-miR168a-5p binding sites. The results of the dual luciferase reporter gene experiment showed that the endogenous increase of osa-miR168a-5p mimics using osa-miR168a-5p can inhibit the expression of ADD1 and E2F2 reporter genes.After mutating the binding site of ADD1 and E2F2 mRNA 3'UTR region to osa-miR-168a-5p， the effect of the endogenous increase of osa-miR-168a-5p on reporter gene expression disappeared.Conclusion  osa-miR168a-5p can directly regulate the expression of human ADD1 and E2F2 genes. Therefore， the entry of osa-miR168a in food into the human body is likely to directly target the human ADD1 and E2F2 genes to exert the corresponding biological effects.
　　Key words：osa-miR168a;ADD1;E2F2;Target gene
　　MicroRNA（miRNA）是一类长度约为22～24个核苷酸的非编码RNA，能够在转录后层面上调控基因表达。miRNA基因在细胞核内转录成原始miRNA，随后在RNAseⅢ-DROSHA的作用下形成具有发卡结构的前体miRNA，再在DICER酶的作用下切割为成熟的miRNA。成熟的miRNA的种子区域（一般为第2～8位核苷酸序列）和靶基因的3'UTR区域结合，进而抑制靶基因转录[1]。miRNA作为重要的转录后调节因子，广泛参与心血管疾病、代谢性疾病、癌症等疾病的发生发展[2-4]。microRNA也可以跨物种进行调节，研究发现[5]，人和动物血清中始终存在外源性的植物miRNA，其中植物miR168a和miR156a表达水平最高，给予小鼠富含osa-miR168a的大米喂养后，血清及肝脏中的MIR168a水平显著升高;进一步研究发现miR168a可以直接靶向结合低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（LDLRAP1）外显子，降低LDLRAP1的蛋白表达。一条microRNA可以调节多个基因的转录，一个基因也可以被多条microRNA调控。因此，除LDLRAP1以外，是否植物MIR168a還可以靶向其他哺乳动物的相关基因尚未可知。基于此，本研究利用生物信息学软件预测osa-miR168a-5p的靶基因，并用双荧光素报告基因系统分析确认，现报道如下。 　　1材料和方法
　　1.1材料与试剂  实验细胞HEK-293细胞购自北京裕恒丰公司;DMEM培养基（GIBCO）、胎牛血清（GIBCO）、青霉素链霉素混合液（南京凯基）、PBS（Hyclone）、胰蛋白酶（GIBCO）、opti-MEM（Invitrogen）、osa-miR168amimics（广州锐博）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）、pmirGLO载体（优宝生物）、双荧光素报告基因检测试剂盒（Promega）。
　　1.2 HEK-293细胞培养及转染  细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于5% CO2，37 ℃恒温培养箱中孵育。转染前1 d，胰酶消化后铺6孔板，使其在转染日密度为70%。转染前首先弃掉完全培养基，加入无血清培养基，每孔细胞使用100 μl opti-MEM稀释2 μg报告基因质粒以及100nm olosa-miR168amimics，混匀;100 μl opti-MEM稀释2μl Lipofectamine2000转染试剂，混匀。将上述两种稀释液混合后室温放置，20 min后将其加入6孔板中，轻轻摇动混匀。转染后的细胞在5% CO2，37 ℃恒温培养箱中孵育6 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基。转染48 h后，检测报告基因活性。
　　1.3双荧光素酶报告基因活性检测  首先裂解细胞，配制相应的裂解液，将5X的PLB溶液用蒸馏水稀释成1XPLB的工作液。6孔板中每孔加入500 μl 1X PLB溶液后置于水平摇床，室温孵育15 min以便充分裂解。裂解后12000 rpm离心5 min，取上清备用。将荧光素酶检测底物溶解于荧光素酶检测缓冲液配置成荧光素酶检测工作液，置于室温。将化学发光仪设置成间隔时间2 s，测定时间10 s。取20 μl细胞裂解液上清，并加入100 μl荧光素酶检测工作液，轻柔混匀后用化学发光仪读数。制备停止反应液体，将试剂盒中的Stop&Glo底物溶解于Stop&Glo缓冲液，加入100 μl停止反应液后混匀并读数。
　　1.4统计学方法  采用Graphpad Prism 8.0统计软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，行t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1预测osa-miR168a-5p靶基因及载体构建  利用TargetScan预测osa-miR168a-5p的靶基因，结果发现ADD1与E2F2mRNA3'-UTR区域均存在osa-miR168a-5p结合位点。osa-miR168a-5p种子区域中有连续6个核苷酸序列与人源ADD1mRNA 3'-UTR区域形成互补序列，另有连续6个核苷酸序列与人源E2F2 mRNA 3'-UTR区域形成互补序列。将ADD1，E2F2mRNA的3'-UTR与osa-miR168a-5p的种子序列的结合度进行预测，并分别以人源ADD1 mRNA和E2F2 mRNA为模板，扩增含有osa-miR168a-5p结合位点的ADD1 3'-UTR序列及含有osa-miR168a-5p结合位点的E2F2 3'-UTR序列，随后将PCR产物通过酶切位点Nhe1和Xba1构建到pmirGLO载体上，得到pmirGLO-ADD1，pmirGLO-E2F2。对ADD1 3'-UTR及E2F2 3'-UTR 的osa-miR168a-5p结合位点进行突变后构建pmirGLO-ADD1突变质粒和pmirGLO-E2F2突变质粒，突变序列见图1。
　　2.2双荧光素报告基因系统分析确证靶基因  使用转染试剂将osa-miR-168a-5pmimics与ADD13'UTRluciferase质粒或E2F23'UTR luciferase质粒以及PRL-TK荧光较准质粒共转染HEK-293细胞后，结果显示与对照组相比，内源性osa-miR168a-5p增加能够降低ADD1及E2F2报告基因的表达，但当ADD1及E2F2mRNA3'UTR区osa-miR-168a-5p的结合位点突变以后，内源性osa-miR-168a-5p增加所引起的报告基因表达下调的作用消失，见图2。
　　3讨论
　　研究发现[5]，哺乳动物血清及器官中存在植物miRNA，其可通过小鼠胃肠道进入机体内，提示不同种属的miRNA可以同时在机体内共存。此外，miRNA可以跨物种进行调节，LaMonte G等[6]研究发现，疟原虫自身无法编码合成miRNA，但在镰型红细胞中，人miR-451、miR-223及miR-19b均在疟原虫中富集，提示miRNA可由宿主向寄生虫迁移。使用miRNA-451、miR223和let-7i转染红细胞后，显著抑制疟原虫的生长，从而抵抗疟疾的发生。Shahid S等[7]发现寄生植物菟丝子也可以通过植物miRNA影响宿主mRNA的表达。Zhou Z等[8]研究发现，在常用的抗病毒药物金银花煎煮后的汁液中存在大量植物microRNA2911，给予小鼠金银花煎煮后的汁液喂养后，小鼠外周血和肺组织中的植物microRNA2911含量显著上调，进一步研究发现microRNA2911可直接靶向甲型流感病毒H1N1，H5N1及H7N9发挥抗病毒作用。以上研究均证实miRNA可以跨越物种发挥转录后调节作用。miR168a是植物中常见的microRNA，番茄中的sly-miR168a能够调节番茄的生长发育和果实成熟;拟南芥中的miR168a能够介导对干旱、盐碱等生物胁迫的响应[9];水稻中的miR168a（osa-miR168a）可以通过调节其靶基因AGO1的表达增加水稻种子的活力[10]。值得注意的是，miR168a是第一个被证实可以跨物种调节的植物miRNA。在哺乳动物体内，osa-miR168a可以靶向調节小鼠肝脏中的LDLRAP1，介导LDLRAP1蛋白表达沉默。目前关于osa-miR168a靶向调节其他哺乳动物基因表达的研究较少，因此对该领域的进行研究具有重要意义。 　　ADD1是内收蛋白基因α亚基编码的蛋白，参与细胞膜钠离子转运和信号转导[11]。研究表明[12]，ADD1基因Gly460Trp位点的多态性与原发性高血压密切相关。ADD1基因启动子区DNA甲基化降低增加原发性高血压的患病风险[13]。此外，ADD1还参与其他心血管疾病（动脉粥样硬化和心肌梗死）、肾脏疾病及肿瘤的发生发展过程[11]。E2F2是E2F转录因子家族中的成员之一，主要参与细胞增殖的调控过程[14]。除此之外，E2F还参与细胞分化、凋亡、自噬等过程[15]。值得注意的是，E2F不仅参与肿瘤的发生发展过程，在血压调节中也发挥重要作用，ZhouJ等[16]研究表明，E2F2全身敲除小鼠呈现高血压;LiH等[17]研究表明，在氧化应激状态下，靶向E2F增加二氢叶酸还原酶的含量以及恢复eNOS的功能能够成功降低血压。本研究使用生物信息学手段预测osa-miR168a-5p的靶基因，挑选ADD1及E2F2进行下游的验证实验，双荧光素酶报告基因实验分析显示，使用osa-miR168a-5p mimics内源性增加osa-miR168a-5p能够显著抑制ADD1及E2F2报告基因的表达。然而将ADD1及E2F2 mRNA 3'UTR区与osa-miR-168a-5p的结合位点突变后，内源性osa-miR-168a-5p增加所引起的报告基因表达下调的作用完全丧失。表明人源ADD1及E2F2基因是osa-miR168a-5p的直接靶基因，证实了osa-miR168a可以调节除LDLRAP1之外的新的人源靶基因ADD1和E2F2的表达，丰富了osa-miR168a可以跨界调节的证据。
　　综上所述，osa-miR168a-5p能够直接调节人源ADD1及E2F2基因表达，食物中的osa-miR168a进入人体很可能直接靶向人源ADD1及E2F2发挥相应的生物学效应。
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　　收稿日期：2020-05-12;修回日期：2020-05-22
　　編辑/杜帆
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