尼罗罗非鱼的Galectin-8基因的原核表达及条件优化

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　　摘 要：Galectin-8属于S型凝集素，是一种内源性凝集素，具有高亲力，含β-半乳糖苷，可识别重要的病原分子[1]。该蛋白质有2个功能结构域，均提供该家族中其他蛋白质类似的保守序列[2]。该研究基于尼罗罗非鱼Galectin-8 NCBI上发表的基因序列，利用primer5.0设计1对引物，构建尼罗罗非鱼Galectin-8基因的原核表达载体，将重组后的质粒pGEX-4T-1-Galectin-8导入大肠杆菌中，通过PCR、连接、转化等，进行原核表达。对影响因素进行条件优化，使用优化后的浓度、时间、温度条件表达Galectin-8重组蛋白能得到最优表达量。Western blot检测纯化后的重组蛋白，结果显示，重组蛋白可以很好地结合GST-Tag标签的单克隆抗体，实验进一步证明罗非鱼Galectin-8的重组蛋白被成功表达，为罗非鱼Galectin-8后续相关功能的研究奠定了基础。
　　关键词：尼罗罗非鱼;Galectin-8;原核表达;Western blotting;条件优化
　　中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）05-0006-04
　　Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-8 Gene in Nile Tilapia
　　Niu Jimin1 et al.
　　（Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China）
　　Abstract： Galectin-8 belongs to S-type lectin， an endogenous lectin with high affinity and β-galactoside， which are important in the recognition of pathogenic molecules[1]. The protein has two functional domains that provide similar conserved sequences to other proteins in the family[2]. Primer5.0 software was used to design a pair of primers based on the Nile tilapia Galectin-8 gene sequence published on NCBI to construct the prokaryotic expression vector of the tilapia Galectin-8 gene. The recombinant plasmid ie pGEX-4T-1 -Galectin-8 was constructed and introduced into E. coli for prokaryotic expression by PCR， ligation， and transformation. Optimal conditions of factors affecting the expression of Galectin-8 recombinant protein in terms of concentration， time， and temperature were provided. The purified recombinant protein was able to specifically bind to the GST-Tag monoclonal antibody detected by Western blot which proved the successful expression of Galectin-8 recombinant protein of tilapia. This result provides the fundamentals to the study of subsequent related functions of tilapia Galectin-8.
　　Key words： Oreochromis niloticus; Galectin-8; Prokaryotic expression; Western blotting; Condition optimization
　　凝集素（lectins）是脂質复合物上的一种非共价结合蛋白或糖蛋白，可选择识别糖结构[3-4]。半乳糖凝集素（galectin）是凝集素中的1个家族，参与免疫应答过程，在其他方面也发挥着重要作用，可以分为3个亚型：原型[5-6]、嵌合体型和串联重复型[7-11]。
　　Galectin-8是1个891bp的开放阅读框（ORF），编码296个氨基酸的蛋白质（33kD）。系统进化树分析表明该蛋白质与来自其他动物物种的半乳糖凝集素8类似，并与鲑鱼半乳糖凝集素8具有至少56.8%的同源性。在结构上，氨基酸序列包括分别为135和133个氨基酸的不同的2个N-和C-末端碳水化合物识别结构域（CRD），通过39个氨基酸的多肽接头连接[7，8，12]，N-和C-CRD含有2个保守的WG-EI和WG-ET基序，表明它们在介导Galectin-8和糖部分如β-半乳糖苷之间的特异性相互作用中具有重要作用[13-15]。
　　尼罗罗非鱼属热带性鱼类，生长快、繁殖力强、病害少、抗病性强等特点，是联合国粮农组织推广养殖的鱼类物种之一[16]。广东沿海一带罗非鱼养殖产量居全国首位。随着养殖密度的增加，养殖环境变得恶化，一些疾病相应增多[17]，细菌性疾病，无乳链球菌就是其中之一，给养殖业带来巨大的经济损失[18-21]。目前罗非鱼免疫系统的研究处于初级阶段，本研究基于Galectin-8基因在NCBI上的全长序列设计引物，克隆Galectin-8的ORF区，构建原核表达载体并优化表达条件，为罗非鱼Galectins的后续研究奠定基础。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料 试验用罗非鱼由湛江附近渔场购买，克隆的载体pMD18-T、T4连接酶、限制性核酸内切酶 BamHI和 XHOI、ExTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，原核表达的载体pGEX-4T（+）Vector和大肠杆菌的表达菌株由本实验室保存。
　　总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;引物合成、氨苄西林（Amp+）、IPTG购自上海生工公司;考马斯亮蓝染液、一抗、二抗购自碧云天生物有限公司;提取质粒和凝胶回收试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 罗非鱼Galectin-8基因的扩增 罗非鱼头肾组织中的总RNA提取按试剂盒说明书进行操作，成功提取RNA后用琼脂糖凝胶检测其质量，按说明书逆转录合成第1条链，根据NCBI上公布的尼罗罗非鱼Galectin-8的基因序列（LOC100696357），以cDNA为模板，设计1对引物的在其5′端加上BamHI和XhoI位点，PF：5’-CGCGGATCC ATGTCCGTGGCTAAC-3’（BamHI）PR：5’-GGCGAGCTCTCACCACAGCTTGATGTC-3’（XhoI），以羅非鱼头肾组织cDNA单链为PCR扩增模板，反应体系参照牛金中等[23]，进行PCR扩增。目的条带用琼脂糖凝胶电泳检测，拍照观察条带大小。目的条带正确后进行纯化回收，将其产物连接到pMD18-T载体上，转化至感受态细胞DH5α中，涂板挑单克隆菌落筛选，结合PCR鉴定是否正确。选择pMD18-T上的通用引物M13/RV鉴定。将阳性克隆送至上海生工测序。序列测序正确的pMD-18-Galectin-8重组质粒和原核表达载体pGEX-4T，提取其质粒，用之前设计的BamHI和XhoI2种快切酶进行酶切，产物切胶回收，16℃、T4 DNA连接酶过夜连接，次日转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中。转化后，用LB平板（含氨苄（Amp+）抗性）挑选单菌落结合菌落PCR鉴定，阳性克隆送生物公司测序。
　　命名测序正确的重组质粒为pGEX-4T-1-Galectin-8。在新鲜的含Amp+LB培养基中接种阳性菌株以及空载质粒pGEX-4T的菌株其比例为1∶100左右，37℃振摇培养，至对数生长期，OD600达到0.4～0.6，IPTG浓度加0.2mmol/L的，诱导2h，对菌液收集，对目的蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
　　1.2.2 重组蛋白Galectin-8条件优化 （1）在不同浓度的IPTG诱导条件下，将浓度梯度设为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和2.0mmol/L，37℃振荡培养3h后，目的蛋白的表达量用聚丙烯酰胺凝胶检测。（2）不同时间的IPTG诱导条件，IPTG浓度为0.6mmol/L，分别诱导1、2、3、4、5、6、7和8h之后收集样品，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量;（3）利用上述优化的表达时间，诱导温度，IPTG诱导浓度，对目的蛋白进行诱导表达，然后对表达菌株收集离心，用PBS洗涤重悬超声破碎。使用超声波细胞粉碎仪对目的蛋白破碎：功率160w，破碎6s，间隔8s，破碎时间为8min，菌液变清撤后4℃离心。成功得到全菌蛋白后，按GST的说明书纯化GST标签的目的蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
　　1.2.3 Western-blot鉴定分析 在最佳诱导条件下，收集纯化重组蛋白。SDS-PAGE电泳后转到PVDF膜上Western blot分析。具体步骤：室温封闭液封闭PVDF膜1h;加入鼠抗GST-Tag单克隆抗体（1∶2500稀释）的一抗，孵育2h;用TBST洗脱膜，在摇床洗脱3次，每次15min;加入HRP山羊抗鼠IgG（1∶4000稀释）的二抗，室温震荡1h;用TBST洗脱膜，在摇床洗脱3次，每次15min;充分清洗后，滴加配制新鲜的DAB显色溶液，待有清晰的条带出现后，用蒸馏水立即终止反应，观察目的蛋白条带的大小，结果拍照保存。
　　2 结果与分析
　　2.1 Galectin-8基因的扩增及鉴定 显示PCR扩增后在891bp处有明显的条带。pMD-18T载体与目的片段相连，PCR扩增用载体上的引物M13和RV，其产物片段约为1046bp，与预期一致。因此，所选菌落为阳性克隆，说明获得的目的条带为Galectin-8基因。
　　2.2 构建Galectin-8原核表达载体 重组Galectin-8的质粒BamHI和XhoI酶切，在891bp处有1条大小接近的条带，与pGEX-4T载体在4969bp处有1条大小一致的条带，且插入的片段测序比对后同样显示是Galectin-8，表明pGEX-4T-Galectin-8被成功构建成原核表达载体。
　　2.3 大肠杆菌的诱导表达 只有诱导的菌株在59kD的位置有条带，未诱导的对照组则无此条带。GST标签的PGEX-4T-1空载体大小是26kD，而Galectin-8预测的蛋白分子量为33kD，重组后的蛋白大小为59kD，该分子量与实验结果一致，从而证明重组Galectin-8蛋白表达成功。
　　2.4 大肠杆菌诱导表达条件优化
　　2.4.1 IPTG最佳诱导浓度和时间 结果显示，在IPTG浓度为0.2mmol/L时，目的蛋白表达量最有效，因此，得出最佳IPTG诱导浓度为0.2mmol/L。当温度和浓度条件一致时，蛋白表达量在1～2h时目的在明显增加，2h后并无明显变化，说明2h是最佳诱导时间。
　　2.4.2 最佳诱导温度 在其他条件不变的情况下，25℃和37℃诱导，收集菌液对蛋白破碎，用SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果证明，在37℃和25℃条件下，目的蛋白都存在。
　　2.4.3 目的蛋白的纯化和鉴定 在IPTG浓度为0.2mmol/L，4h，37℃条件下，收集菌液纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测分析。结果显示：纯化后的目的蛋白条带单一。Western blot显示，重组蛋白纯化后能特异性结合GST-Tag单克隆抗体，说明罗非鱼Galectin-8带重组蛋白表达成功。 　　3 讨论
　　本研究以大肠杆菌为表达系统对罗非鱼Galectin-8进行原核表达，这是蛋白表达最常使用的表达系统。大肠杆菌在实验过程中也会影响到蛋白的表达量，所以在优化培养中PH可以适当提高避免抑制蛋白表达。氧气要充足，摇菌时注意容器中菌液量不能太多，对数生长期时能提高重组蛋白的表达量，IPTG的浓度、时间、温度对其表达量影响也很大。本试验主要对IPTG的浓度、时间、温度进行条件优化[23-24]。在37℃，2h且IPTG浓度为0.2mmol/时目的蛋白表达量处于最佳，浓度过高有时会抑制目的蛋白的表达[25]。当温度在25℃时，目的蛋白比37℃时的表达量明显减少，因此本研究得出温度对蛋白表达及其重要。用优化后的条件表达Galectin-8重组蛋白，纯化目的蛋白使用GST镍柱，Western blot检测其分子量，证明无论是重组蛋白的全菌蛋白还是纯化后的重组蛋白，均与GST标签的单克隆抗体有效结合，且目的条带单一，进一步说明表达的重组蛋白是Galectin-8。
　　本试验在最佳诱导条件下成功构建尼罗罗非鱼Galectin-8的原核表达，且Galectin-8重组蛋白的表达量最大。纯化后的Galectin-8重组蛋白，为后续制备罗非鱼Galectin-8的抗体及其它方面的功能研究奠定最重要的一步。
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