宜昌地区杂交籼稻品种DNA指纹图谱构建

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　　摘要 通过SSR引物多态性分析，构建了宜昌地区49份杂交籼稻品种的DNA指纹图谱。35对SSR引物共检测到61个多态性位点，其中最少的为2个，最多的为6个，平均每对引物可以检测到2.5个位点。利用10对核心引物，构建了不同杂交籼稻品种DNA指纹图谱，为宜昌地区水稻品种保护和种子鉴定提供了基础。
　　关键词 水稻;SSR;DNA;指纹图谱
　　中图分类号 S 511.2+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）16-0109-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.029
　　Construction of DNA Fingerprint of indica Hybrid Rice Varieties in Yichang Area
　　ZHANG Nu， SHEN Lu-lu， DU Qin et al
　　（Yichang Seed Supervision Station， Yichang， Hubei 443005）
　　Abstract To establish DNA fingerprint of indica hybrid rice varieties in Yichang area， 49 tested varieties were studied using SSR markers. The results showed that 35 pimers detected 61 alleles in total among 49 varieties， with 2-6 alleles （2.5 alleles an average） amplified by each primer. According to the analysis of 10 pairs of core SSR markers， we constructed DNA fingerprint database for 49 indica hybrid rice varieties， which would be helpful for the application of SSR markers in rice variety and purity identification in Yichang area.
　　Key words Rice;SSR;DNA;Fingerprint map
　　作者簡介 张弩（1966—），男，湖北枝江人，正高职高级农艺师，硕士，从事农作物种子监管、质量检测及推广工作。
　　收稿日期 2020-03-01
　　
　　水稻是世界主要粮食作物之一。杂交水稻的研究和推广为我国粮食安全提供了重要保障。水稻种子产业快速发展是杂交水稻大面积推广的前提条件，而现今不同程度的水稻品种雷同、侵权等现象已经制约了水稻种子产业的发展，构建水稻品种种子身份证是解决这一问题的有效途径。
　　分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，具有准确性高、信息量大、稳定性好等优点;利用分子标记构建DNA指纹图谱已成为农作物品种真伪性鉴定的发展趋势和重要手段。SSR（simple sequence repeat）标记是一种共显性分子标记，具有操作简单、多态性丰富、稳定性好等优点[1-2]，在农作物DNA指纹图谱构建、遗传多样性分析、基因克隆等方面得到了广泛的应用[3-7]。利用SSR标记构建DNA指纹图谱在杂交水稻研究方面已有不少报道。蔡海亚等[8]报道了湖北省两系不育系指纹图谱构建;陆徐忠等[9]通过建立SSR指纹图谱，构建了杂交水稻亲本身份证;徐港明等[10]对太湖地区24份杂交粳稻进行了指纹图谱构建及遗传相似性分析。但关于杂交籼稻不同品种DNA指纹图谱的报道不多。该研究通过SSR引物多态性分析，构建了宜昌地区49份杂交水稻品种的DNA指纹图谱，以期为宜昌地区水稻生产过程中品种培育、品种鉴定提供理论基础和技术支撑。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　49份杂交籼稻材料种子由宜昌市种子监督站提供。其中三系杂交稻14份，两系杂交稻35份，品种名称、来源及类型见表1。种子催芽7 d后取芽苗，液氮冷冻后，-70 ℃低温冰箱保存。
　　试验所用分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
　　1.2 DNA提取
　　采用CTAB法提取基因组DNA[11]，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，通过核酸蛋白仪测定所有样品的DNA浓度，再用适量TE稀释为相同浓度，-20 ℃保存备用。
　　1.3 PCR扩增
　　扩增反应在Biometra T-Gradient PCR仪上进行。反应体系20 μL，包括10×Buffer 2 μL、DNA模板30 ng、1.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、0.5 U Taq DNA聚合酶;扩增条件为94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环;72 ℃延伸 5 min。
　　1.4 电泳检测
　　取1.5 μL PCR 扩增产物与溴酚蓝混匀，10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，用 NaOH 银染方法进行染色显影，凝胶成像系统采集图像。
　　1.5 数据统计及分析
　　通过观察聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，进行带型统计，只统计清晰主带，忽略杂带、弱带。同一水平上有条带记为1，没有条带记为0，转化为1/0格式[12]。
　　2 结果与分析
　　2.1 多态性引物筛选 　　利用已经建立的水稻SSR分子标记体系，挑选分布于水稻12条染色体上120对SSR引物，从试验材料中随机挑选4个品种，进行SSR多态引物筛选。结果发现，35对SSR引物能在不同杂交籼稻品种间扩增出差异性条带，多态性引物占可扩增引物的29.2%。35对多态性引物共检测到61个多态性位点，最少的为2个，最多的为6个，平均每对引物可以检测到2.5个位点，表明35对引物对49份测试材料具有较好的多态性，部分多态性引物序列见表2。
　　2.2 宜昌地区杂交籼稻品种的SSR多态性分子标记分析
　　从筛选出的SSR多态性引物中，选取扩增条带清晰、分辨率高的引物，对宜昌地区49个杂交籼稻品种进行多态性分析（图1）。综合考虑引物扩增的有效等位基因数、杂合度、多态性信息含量以及扩增产物分子量大小等因素，确定了 10对引物，作为构建宜昌地区不同杂交籼稻品种DNA指纹图谱的核心引物。10对核心引物分别为R1-2193、R2-2876、R3-1658、R4-27、R4-3321、R5-744、R5-2790、R7-2122、R8-978、R11-251（表2）。
　　2.3 DNA指纹图谱构建
　　根据10对核心引物扩增出的等位基因分子量大小，对不同品种 DNA 等位基因进行赋值编码，没有扩增出等位基因的赋值0，扩增出等位基因的赋值1，将编码依次串联在一起就形成该品种的DNA指纹数据库编码，最终得到宜昌地区不同杂交籼稻品种 DNA 指纹数据库（表3）。
　　3 讨论
　　该研究选用35对SSR引物，对49份杂交籼稻品种进行多态性分析，共检测到61个多态性位点，最少的为2个，最多的为6个，平均每对引物可以檢测到2.5个位点，明显低于已有的一些研究报道。黄瑞等[6]报道36对SSR引物在62份水稻材料中检测到192个等位基因，平均每个位点5.3个等位基因;唐浩等[13]报道用24对SSR引物在19个籼稻和30个粳稻品种中分别检测到141和156个位点，平均每对引物可以检测到5.88（籼稻）和6.50（粳稻）个等位位点。究其原因，除了所用的引物不同外，该研究所用试验材料都是杂交籼稻品种，由于在育种过程中基础育种材料的广泛交流，不同水稻品种之间的趋同性增强可能也是主要原因之一;另外，在统计条带的过程中，只记录了100～300 bp清晰的主带，其他条带没有统计也是导致引物扩增位点减少的一个因素。
　　依据较少引物构建指纹图谱的原则，选用R1-2193等10对引物（表2）作为构建宜昌地区49份杂交籼稻DNA指纹图谱的核心引物。没有1对核心引物能单独区分测试水稻材料，必须多对引物结合分析才能区分。在构建的不同水稻品种DNA指纹图谱中，除了丰两优一号与丰两优二号、荃优822与荃优粤农丝苗外，其他品种都具有唯一的DNA指纹图谱。虽然用更多的多态引物进行了分析，但也没有能够找到有效区分丰两优一号与丰两优二号、荃优822与荃优粤农丝苗的标记，可能与它们品种之间遗传背景高度相似有关。
　　 利用SSR标记构建DNA指纹图谱在水稻中已经得到了广泛应用。在2007年农业农村部颁布《水稻品种鉴定DNA指纹方法》（NY/T 1433—2007）中，推荐了24个SSR引物;在2014年修订的《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T 1433—2014）中，推荐了48个SSR引物。随着水稻新品种的不断增多，需要发掘更多的SSR标记来满足水稻DNA指纹图谱构建和新品种鉴定的需要。该研究筛选出35对特异性强、稳定性好、多态性丰富的SSR引物，对今后水稻品种DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析等研究具有参考价值，为我国水稻新品种的审定以及新品种的分子遗传多态性评价提供了一定的技术支持。
　　参考文献
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