miR-200b-Notch信号通路对诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的调控作用

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　　摘要：目的  探究miR-200b靶向Hes1调控Notch信号通路对iPS细胞向神经干细胞分化的影响。方法  采用结合维甲酸和无血清培养基诱导法诱导iPS细胞向神经干细胞分化，分别在诱导分化的第0、4、8、15d采用实时荧光定量PCR检测miR-200b水平，Westernblot法检测Hes家族bHLH转录因子1（Hes1）、Notch1蛋白水平，应用生物信息学软件预测并通过荧光素酶报告实验验证miR-200b与Hes1之间的靶向结合作用。结果  在iPS细胞向神经干细胞分化诱导分化的第0、4、8、15d，miR-200b水平逐渐升高，Hes1、Notch1蛋白水平逐渐降低，差异有统计学意义（P<0.05）;生物信息学分析显示，Hes1为miR-200b的靶基因，过表达miR-200b可升高神经干细胞分化，上调Hes1水平调控Notch信号通路相关分子。结论  miR-200b可促进iPS细胞向神经干细胞分化，其机制可能与其靶向上调Hes1表达，进而促进Notch信号通路的激活有关。
　　关键词：诱导性多能干细胞;神经干细胞;miR-200b-Notch;信号通路
　　Abstract：Objective  To explore the effect of miR-200b targeting Hes1 to regulate the Notch signaling pathway on the differentiation of iPS cells into neural stem cells.Methods  Combining retinoic acid and serum-free medium was used to induce iPS cells to differentiate into neural stem cells. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the level of miR-200b on the 0th， 4th， 8th， and 15th d of the induced differentiation， and the Hes family was detected by Western blot method. The bHLH transcription factor 1 （Hes1） and Notch1 protein levels were predicted by bioinformatics software and the targeted binding effect between miR-200b and Hes1 was verified through the luciferase report experiment.Results  On the 0th， 4th， 8th， and 15th d after the differentiation of iPS cells into neural stem cells， the level of miR-200b gradually increased， and the levels of Hes1 and Notch1 protein gradually decreased，the difference was statistically significant （P<0.05）; Bioinformatics analysis showed that Hes1 is the target gene of miR-200b. Overexpression of miR-200b could increase the differentiation of neural stem cells and up-regulate Hes1 levels to regulate Notch signaling pathway related molecules.Conclusion  miR-200b could promote the differentiation of iPS cells into neural stem cells， and its mechanism might be related to its targeted up-regulation of Hes1 expression， which in turn promoted the activation of Notch signaling pathway.
　　Key words：Induced pluripotent stem cells;Neural stem cells;miR-200b-Notch;Signaling pathway
　　誘导性多能干细胞（iPS）是一类与胚胎干细胞（ES）具有相似全能分化特性的重编程多能干细胞，目前已有研究证实[1]，iPS可定向分化为神经干细胞、神经前体细胞等，而且通过iPS细胞体外定向诱导分化的细胞在其相应疾病治疗中可获得较为理想的效果，但是关于iPS诱导分化的具体调节机制目前尚未完全确切。近年，越来越多研究发现[2，3]miR-200b和Notch信号在胚胎干细胞的增殖与分化发挥着重要的调控作用，然而miR-200b和Notch信号是否能够调控iPS细胞向神经细胞定向分化的机制并不清楚。为此，本研究拟通过重组慢病毒技术、qRT-PCR等技术观察iPS细胞定分化为神经干细胞过程中mir-200b、Notch通路等相关信号分子的表达变化及作用，旨在阐明iPS细胞神经定向分化的具体调控途径，报道如下。
　　1材料与方法
　　1.1实验材料  iPS-S细胞系（上海亞遊生物科技有限公司），TRIzon总RNA提取试剂（上海联迈生物），Fast Super RT Kit cDNA第一链合成试剂盒（上海一基生物），Ultra SYBR Mixture试剂盒（上海研谨生物），兔抗人 Notch1 单克隆抗体、兔抗人Hes1多克隆抗体（博士德生物公司）。 　　1.2方法
　　1.2.1诱导iPS细胞向神经干细胞分化  把iPS细胞接种在含有丝裂霉素C的鼠胚胎成纤维细胞的饲养层，集落长满后加入胶原酶消化，先在无血清培养基悬浮培养4 d，随后置于含有维甲酸的神经干细胞培养基诱导培养4 d，再在神经干培养基中悬浮培养7 d，最后接种到经层粘连蛋白包被的24孔板中培养，分别收集诱导分化的第0、4、8、15天的细胞备用。
　　1.2.2实时荧光定量PCR检测  ①总RNA提取：取适量细胞样本，加入1 mlTRIzon液的比例加入适量TRIzon液混匀，按照试剂盒说明书进行总RNA提取。②cDNA合成：应用RT-PCR法进行检测，取5 μl RNA为逆转录模板，以U6 RNA为内参基因，严格按照Fast Super RT Kit cDNA第一链合成试剂盒进行操作，加入miRNA茎环引物充分震荡混匀，并予以短暂离心处理以使溶液集中于EP管底。然后将其置于42 ℃环境中孵育30 min，置于85 ℃中孵育3 min。最后对其进行短暂离心处理，并放在冰上冷却获得逆转录产物cDNA。③实时定量PCR反应：严格按照Ultra SYBR Mixture试剂盒说明书进行荧光实时定量PCR实验，设置反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性95℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40个循环，进行扩增反应，计算miR-200b表达量。
　　1.2.3 Westernblot检测  用RIPA裂解诱导分化的第0、4、8、15天样本细胞提取的总蛋白，先采用紫外分光光度计检测蛋白的浓度，利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳将蛋白转移至PVDF膜，进行封闭处理，添加兔抗人 Notch1 单克隆抗体、兔抗人Hes1多克隆抗体，4 ℃孵育后进行3次TBST洗膜，添加二抗在室温下孵育1 h，随后加入ECL化学发光试剂盒检测杂交信号，曝光后扫描胶片，使用Image J软件分析各蛋白条带的灰度值，以β-actin蛋白作为内参，计算出目标蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值，即为Hes1、Notch1蛋白相对表达量。
　　1.2.4荧光素酶报告基因实验检测  应用TargetScan miRNA靶基因预测miR-200b在Hes1上的结合位点，构建Hes1的3’-非编码区、Notch1的3’-非编码区报告基因质粒，以此转染至miR-200b稳定表达，根据Dual-Luciferase（Promega）双荧光素酶报告系统试剂盒说明书检测荧光素酶相对活性。
　　1.3统计学方法  应用统计学SPSS23.0软件对实验数据进行分析，计数资料采用（%）表示，行？字2检验;计量资料以（x±s）表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　在iPS细胞向神经干细胞分化诱导分化的第0、4、8、15天，miR-200b水平逐渐升高，Hes1蛋白、Notch1水平逐渐降低，不同时间点其表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。生物信息学分析显示，Hes1为miR-200b的靶基因，过表达miR-200b可升高神经干细胞分化，上调Hes1水平调控Notch信号通路相关分子，见图2、图3。
　　3讨论
　　作为一种神经前体细胞，神经干细胞具有自我更新并分化为神经元、星形胶质细胞等大脑各类细胞的功能。从理论上来讲，神经干细胞有多向分化的潜能，因诱导多能干细胞（iPS细胞）可分化为多种能够用于中枢神经系统疑难疾病的细胞替代治疗，具有广大应用前景[4]。然而，在实际临床应用中，神经干细胞的替代治疗仍处于非常早期基础研究阶段，而且受免疫排斥、伦理等问题影响，尚不能将iPS细胞诱导为任意细胞，通常是诱导后的细胞中包含多种细胞类型。因此，探究iPS细胞诱导分化的调控机制对于其临床应用有重要意义。
　　miRNA是由21～25个小分子核苷酸所组成的非编码RNA，广泛分布在哺乳动物基因组，其能够通过靶向作用于蛋白编码基因，阻止蛋白质的转录与翻译，进而参与细胞发育、分化增殖、凋亡等多项生理过程[5]。多项研究显示[6]，多种miRNA可调控神经干细胞调节因子表达水平，在干细胞的调控、自我更新功能发挥着重要的作用。miR-200b为一种新型miRNA，有研究报道[7]，miR-200b在脑肿瘤组织中的表达水平较正常脑组织显著升高。笔者在前期课题研究中发现在iPS细胞向NSC定向分化的过程中，miR-200b表达量明显升高，我们推测miR-200b可通过其靶基因Notch1介导Notch信号通路调控了iPS细向NSC的定向分化过程。蒋明等[8]的研究也发现，诱导分化神经干细胞过程中miR-200b有可能是Notch信号通路的重要调控因子。
　　bHLH基因对于神经干细胞的增殖、分化、自我更新能力有重要的作用。Hes家族中的7个成员均为bHLH基因，其中Hes1、Hes5为Notch基因的靶基因，其表达水平极易受Notch因子的增殖活化而上调。动物实验研究证实[9]，Notch通路在诱导iPS细胞向神经干细胞分化调控中起着重要作用，也是维持神经干细胞自我更新的关键。房裕钞等[10]的研究提出，在脑缺血再灌注损伤机制中miR-200b可通过Notch信号通路下调Hes1表达。秦杰等[11]研究报道Notch1和Hesl激活在调控神经干细胞中的作用，当敲除Hes1、Notch1基因时，不成熟神经元分化数量会显著增加，致使大范围神经发育缺陷，提示在神经正常发育过程中，Hes1、Notch1对维持神经干细胞的特性是必需的。本研究结果显示，在iPS细胞向神经干细胞分化诱导分化的第0、4、8、15天，miR-200b水平逐渐升高，Hes1、Notch1蛋白水平逐渐降低，且经生物信息学分析证实Hes1为miR-200b的靶基因，可知miR-200b在体外促进神经干细胞分化是通过抑制Notch信号通路来实现的。目前已有大量研究发现[12]，Notch信号通路在神经发育过程中发挥着重要的作用。在神經发育过程中，表达于中枢神经系统的Notch配体、受体均与神经前体细胞的增殖、维持及分化等过程密切相关[13]。有研究指出[14]，激活Notch信号通路有利于促进神经干细胞增殖，而抑制Notch信号通路可对神经干细胞分化发挥促进作用。正鉴于此，笔者推敲Notch通路有可能参与miR-200b对神经干细胞神经分化的调节过程，miR-200b过表达可使神经干细胞Notch信号通路下游靶基因Hes1表达水平下降，进而抑制Notch信号通路，促进神经干细胞分化。 　　综上所述，miR-200b可促进iPS细胞向神经干细胞分化，其机制可能与其靶向上调Hes1表达，进而促进Notch信号通路的激活有关。
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　　收稿日期：2020-05-09;修回日期：2020-06-12
　　编辑/成森
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