山地五月茶提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制活性研究

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　　摘  要：为深入了解海南岛热带野生植物的保健功能及其活性成分，用CCK-8法检测山地五月茶（Antidesma montanum）果和叶的乙醇提取物对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制活性。结果表明，山地五月茶果和叶的乙醇提取物作用72 h对细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为483 μg/mL和306 μg/mL。叶的乙醇提取物分别经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，比较各有机溶剂萃取相及剩余水相对乳腺癌细胞抑制增殖活性，结果显示乙酸乙酯相表现出较高的活性，其处理细胞72 h的IC50为150.5 μg/mL。划痕实验和Transwell检测结果表明，乙酸乙酯相提取物具有抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的能力。流式细胞仪检测结果表明，乙酸乙酯相提取物能够使MDA-MB-231细胞周期S期显著延长。UPLC-MS/MS分析结果显示，乙酸乙酯相含有穗花杉双黄酮活性成分。穗花杉双黄酮处理MDA-MB-231细胞72 h的抑制增殖IC50為192.6 μg/mL，表明其是山地五月茶抑癌活性成分之一。
　　关键词：天然产物;活性成分;乳腺癌;山地五月茶
　　中图分类号：R284.2      文献标识码：A
　　Abstract： In order to understand the health function and active components of tropical wild plants in Hainan Island the ethanol extract of the fruits and leaves of Antidesma montanum inhibiting the proliferation of breast cancer cells MDA-MB-231 by the CCK-8 method was studied in this research. The IC50 were 483 μg/mL and 306 μg/mL after 72 h treatment. The ethanol extract of the leaves of A. montanum was separated by petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol and water respect. The ethyl acetate phase showed higher inhibitory activity than other phases， and the inhibition proliferation IC50 was 150.5 μg/mL after 72 h treatment. Through the wound healing and transwell test， the ethyl acetate phase showed inhibition in migration and invasion activity of MDA-MB-231 cells. The active components could make the S phase in cell division delayed by flow cytometry detection. One of the components was identified as amentoflavone analyzed by UPLC-MS/MS. The IC50 of amentoflavone inhibition proliferation of MDA-MB-231 cells was 192.6 μg/mL after 72 h treatment， which showed it’s one of the active ingredients in the leaves of A.montanum.
　　Keywords： natural products; active ingredients; breast cancer; Antidesma montanum
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.025
　　山地五月茶（Antidesma montanum）属大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠亚科（Phyllanthoideae Ascherson）五月茶属（Antidesma）植物。该属植物广泛分布于东半球热带地区，常被作为绿化观赏树种。五月茶属植物全球约170种，我国有16种，主要分布于广东、广西、福建、贵州、云南和海南等地[1]。五月茶的果实可用于制造果酱、果汁和红酒等，在泰国、菲律宾、印度尼西亚等国是重要的经济作物，其嫩叶还可代茶冲泡饮用或作为蔬菜食用[2]。我国传统医药书籍记载五月茶的根、果、叶均可入药，《常用中草药彩色图谱》中记载五月茶具有“收敛，止泻，止渴生津，行气活血”的药用活性，能“治津液少，消化不良，跌打损伤”[3]。国内外研究结果显示，五月茶的茎叶中含有酚酸、环肽和三萜类成分，在抗氧化、抗病毒、抗抑郁等方面具有较好的药理活性[4-8]。
　　当今世界乳腺癌是女性发病率最高的癌症，每年全世界约有50万妇女死于乳腺癌[9]。MDA- MB-231是一种恶性乳腺癌细胞，具有转移快、侵袭性高、局部复发早、预后差等特点。化疗是该类患者目前唯一有效的治疗手段，急需寻找新的治疗药物及治疗方法[10]。从植物中发掘治疗肿瘤的活性药物一直是全球医药科研工作者研究的方向，来自植物的紫杉醇（paclitaxel）是治疗乳腺癌和卵巢癌广泛使用的药物，但存在水溶性低、不良反应大等缺点[11]。本研究通过分离鉴定海南山地五月茶果和叶中抑制乳腺癌细胞增殖的活性成分，为山地五月茶叶的深入开发提供理论基础。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  材料与试剂  山地五月茶（A. montanum）的果和鲜叶均采自海南省万宁市兴隆镇中国医学科学院药用植物研究所海南分所南药园。采集的果和叶于40 ℃烘干后粉碎，过40目筛，加入5倍体积的80%乙醇浸泡24 h，超声辅助提取3次，每次30 min。提取液经过减压旋转蒸发浓缩近干，以超纯水溶解后，依次用石油醚（30～60 ℃沸程）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相经减压旋转蒸发浓缩去除溶剂，冷冻干燥后20 ℃冰箱保存。
　　乳腺癌细胞MDA-MB-231，购自中国科学院昆明细胞库。用含有10%新生胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM 高糖型培养基培养，培养条件为37 ℃、5%二氧化碳。取对数生长期细胞进行后续实验。
　　DMEM培养基、胎牛血清、CCK-8试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司;结晶紫、羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、穗花杉双黄酮标准品（HPLC≥98%），上海源叶生物科技有限公司;胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素溶液、PBS缓冲液，合肥Biosharp生物科技公司;RNase A溶液，北京索莱宝科技有限公司;细胞核染料PI染色液，江苏凯基生物技术股份有限公司。
　　1.1.2  仪器与设备  Thermo 3111二氧化碳培养箱、MUTiskan GO酶标仪，美国Thermo Fisher公司;Axiovert 40 CFL荧光倒置显微镜，德国Zeiss公司;BD FACSCalibur流式细胞仪，美国BD Bioscience公司;UltiMate? 3000高分辨液质联用仪UPLC-MS/MS，美国Thermo Fisher公司;SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Agilent Technologies公司。
　　1.2  方法
　　1.2.1  抑制增殖活性检测（CCK-8法）  在96孔板中接种对数生长期的MDA-MB-231细胞，每孔接种2000个，待细胞贴壁后加入不同浓度提取物的DMEM培养基（含0.25%HEPES），以0.1% DMSO的DMEM培养基为空白对照。在处理72 h后，吸除旧培养基，加入10 μL的CCK-8及90 μL培养基，放入CO2培养箱静置1 h后，用酶标仪读取405 nm吸光度。按照下列公式计算细胞活力：
　　细胞活力=（A空白组A处理组）/A空白组
　　用Graphpad Prism 8软件以提取物浓度的对数值log （X）为横坐标，提取物的吸光度与对照吸光度的百分比值为纵坐标，做非线性回归分析，获得抑制细胞增殖的IC50。
　　1.2.2  细胞迁移活性检测（划痕实验）  在24孔板中接种对数生长期的MDA-MB-231细胞，每孔2×105个细胞，二氧化碳培养箱培养24 h，待细胞贴壁后用枪头划痕，用PBS缓冲液洗去漂浮细胞，加入不同浓度提取物，24 h后用结晶紫染色细胞，在显微镜下拍照，用ImageJ软件统计处理前后划痕面积变化，计算抑制迁移率。
　　1.2.3  细胞侵袭实验  山地五月茶葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相分别配置成25、50、100 μg/mL的DMEM培养基，用含有不同浓度提取物的培养基培养MDA-MB-231细胞24 h，经胰酶消化细胞脱壁，用不含牛血清的培养基制备成4×104个/mL 的细胞悬液加入 Transwell小杯（置于24孔板中），Transwell的下层加入含10%牛血清的培养基，37 ℃培养箱培养24 h，用棉签擦去孔内细胞，75%乙醇固定0.5 h后用结晶紫染色1 h，洗去多余染液，在显微镜下随机选取5个视野拍照，并计数细胞个数，取5个视野的平均数表示肿瘤细胞的体外迁移和侵袭数。
　　1.2.4  流式细胞仪检测细胞周期变化  用6孔板，每孔接种5×105个对数生长期的MDA-MB- 231细胞，以含50 g/mL的山地五月茶叶乙酸乙酯萃取相的培养基处理24 h后，以不含EDTA的胰蛋白酶使细胞脱壁，经预冷的PBS洗2遍，1500 r/min离心5 min，弃上清并用预冷的PBS洗2遍，用预冷的70%乙醇固定，20 ℃冰箱过夜。检测前用预冷的PBS洗2遍，离心、弃上清，加入2 μL浓度为1 mg/mL的核糖核酸酶（RNaseA），37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI染色液，暗处反应30 min后，用流式细胞仪检测提取物对细胞周期的影响。
　　1.2.5  UPLC-MS/MS分析  将活性组分进行UPLC-MS/MS分析，以甲醇（A）和0.5%甲酸水
　　溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，40%～ 60%A;15～25 min，80%A;25～30 min，40% A）。流速0.4 mL/min，柱温28 ℃，进样体积10 μL。质谱检测条件：电喷雾离子源（ESI），正负离子模式，雾化N2体积流量为800 L/h，脱溶剂气温度为400 ℃，锥孔气流量为50 L/h，离子源温度100 ℃，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40 V，离子喷雾电压（ESI）2200 V和（ESI+）3000 V;MSE扫描模式检测，扫描范围m/z 100～1500 。
　　1.3  数据分析
　　所有实验均设3次以上重复，采用Graphpad Prism 8.0.1软件进行数据处理，并进行差异显著性分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  提取物对乳腺癌细胞增殖的抑制
　　分别将山地五月茶的果和叶乙醇提取物用DMSO溶解，DMEM培养基稀释至一定浓度，测试其对MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制活性，结果见图1。乙醇提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖的活性，随浓度增加而增强。果和叶的乙醇提取物对MDA-MB-231细胞72 h的IC50分别为483 、306 μg/mL，叶提取物的抑制增殖活性高于果的提取物。 　　分别将山地五月茶叶乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取相及水相提取物的浓度稀释至200 μg/mL，检测其对MDA-MB-231细胞增殖的抑制活性。结果表明，在几种萃取相中，乙酸乙酯萃取相的抑制细胞增殖活性最高，水相的活性最低（图1C）。进一步分析乙酸乙酯萃取相在不同浓度时对MDA-MB-231细胞增值的抑制作用（图1D），计算得出其作用72 h的IC50为150.5 μg/mL。
　　2.2  提取物对细胞迁移的影响
　　考察山地五月茶叶乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞迁移活性的影响，结果表明100 μg/mL的乙酸乙酯萃取相处理MDA- MB-231细胞24 h后，与对照相比提取物对细胞迁移的平均抑制率达86%（图2）。本研究还考察了更低浓度提取物处理对细胞迁移活性的影响，结果显示随着提取物浓度的降低，其对细胞迁移的抑制率也逐渐减小。
　　2.3  提取物对细胞侵袭的影响
　　不同浓度山地五月茶叶提取物的乙酸乙酯萃取相处理乳腺癌MDA-MB-231细胞，图3结果表明，随着浓度的提高，乙酸乙酯萃取相提取物对MDA- MB-231细胞迁移抑制活性也提高。25、50、100 μg/mL提取物处理后的穿过膜孔的细胞数量分别为对照的69.9%、37.6%和34.3%，表明五月茶叶提取物的乙酸乙酯萃取相中含有抑制MDA- MB-231细胞侵袭的活性成分。
　　2.4  提取物对细胞周期的影响
　　通过流式细胞仪检测山地五月茶叶提取物乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞周期的影响，结果见图4。由结果可知，以50 μg/mL的乙酸乙酯萃取相处理细胞24 h，能增加G0/G1期和S期细胞的数量，减少G2期的细胞数量。与空白对照相比，G0/G1期细胞的数量平均由54.5%增加到55.6%，S期细胞数由25.6%增加到32.0%，G2期细胞数量由14.5%减少到6.5%。说明山地五月茶乙酸乙酯萃取相活性成分能够阻滞MDA-MB- 231细胞周期在S期，从而抑制其增殖。
　　2.5  提取物活性成分的UPLC-MS/MS分析
　　经过UPLC-MS/MS分析山地五月茶叶乙酸乙酯萃取相活性组分组成，在22.3 min出峰的成分经质谱鉴定为穗花杉双黄酮（图5）。穗花杉双黄酮的分子量为538.4579，分子式为C30H18O10，实际质谱检测其分子离子峰m/z 539.1001为[M+H]+，m/z 615.1444为[M+Na]+离子特征峰（图6）。穗花杉双黄酮标准品的液相出峰时间及质谱信息与山地五月茶叶乙酸乙酯萃取相活性组分中一致，认定其为同一种物质。
　　2.6  活性成分抑制细胞增殖活性
　　穗花杉双黄酮标准品配制成浓度为500、250、125、62.50、31.25 μg/mL的DMEM细胞培养液，处理MDA-MB-231细胞72 h的抑制细胞增殖IC50为192.6 μg/mL，说明穗花杉双黄酮化合物具有抑制MDA-MB-231细胞增殖的活性（图7）。
　　3  討论
　　本研究对山地五月茶（A. montanum）果实及叶提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用进行了研究，山地五月茶叶提取物主要活性物质在乙酸乙酯萃取相，其对细胞的抑制增殖作用具有剂量依赖性，可将乳腺癌细胞S期延长，导致细胞不能增殖。划痕实验和Transwell实验结果证明，山地五月茶叶的提取物能有效抑制MDA- MB-231细胞的迁移和侵袭。
　　国外早期研究显示，五月茶（A. bunus）叶和果实的甲醇粗提物对卤虫藻（Artemia salina）有细胞毒活性[12]。五月茶全株含有多种维生素如硫胺素（thiamine）、核黄素（riboflavine）、烟酸（nicotinic acid）[13]，果实中含有较多的没食子酸（gallic acid）、（-）-表儿茶素[（-）-epicatechin]、（+）-焦儿茶酸[（+）-catechin]、矢车菊素（cyanidin-3-O- glucoside）[14]。研究表明，山地五月茶（A. montanum）地上植株含有黄酮类、甾萜类、生物碱类、酚类、蒽醌类成分，乙酸乙酯相提取物有抗炎活性[15-16]。
　　本研究的结果也表明，山地五月茶（A. montanum）叶提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖的活性成分主要在乙酸乙酯萃取相，乙酸乙酯萃取相中主要活性成分是一种黄酮类物质——穗花杉双黄酮（amentoflavone），该萃取相其他组分的化学结构及细胞活性有待进一步研究。
　　穗花杉双黄酮最早是从卷柏（Selaginella tamariscina）中分离的一种多酚化合物[17]，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖及抗肿瘤等多种生物学活性[18-19]。Lee等[20]研究表明穗花杉双黄酮通过抑制脂肪酸合成酶而抑制SK-BR-3乳腺癌细胞的增殖。本研究发现，山地五月茶（A. montanum）的叶中含有穗花杉双黄酮，是其抑制乳腺癌细胞增殖的活性成分之一。
　　通常癌症的形成需要几十年的时间，在饮食中注意长期持续摄取具有抑制癌细胞生长的食物是预防癌症的一种可取的生活方式。山地五月茶能够抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭活性，有望开发为具有预防和治疗乳腺癌功能的保健茶产品。
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