25种黔产中药材提取物体外抑菌活性的筛选

来源:用户上传      作者:周艺 李洪菲 郭建军 任欢 汪群豪 陈晓青

　　【摘 要】 目的：选取25种黔地中药材，研究其70%乙醇提取物对临床常见致病菌的体外抑菌活性。方法：中药粗粉用70%乙醇回流提取，通过纸锭琼脂扩散法测定提取物的抑菌圈，微量倍比稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果：25种黔产中药材醇提物中，有15种中药材对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出不同程度的抑菌效果。其中，黄连、夏枯草、大黄、鱼腥草、金钱草等5种中药材对两种病原菌的抗菌活性较为突出，抑菌圈d≥20 mm;对两种病原菌的最低抑菌浓度范围在7.82～31.25 mg/mL之间;对两种病原菌的最低杀菌浓度范围在15.625 ～62.50 mg/mL之间。结论：首次筛选出的5种抗菌活性较强的黔产中药材，可为抗耐药性的中药抑菌剂和抑菌日化产品的开发提供一定的科学依据。
　　【关键词】 黔产中药材;金黄色葡萄球菌;大肠杆菌;最低抑菌浓度;最低杀菌浓度
　　【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）9-0032-07
　　Screening of antibacterial activity in vitro of 25 kinds of Chinese medicinal materials from guizhou
　　ZHOU Yi1 LI Hongfei3 GUO Jianjun2，3* REN Huan3 WANG Qunhao3 CHEN Xiaoqing4
　　1.High School， Anshun University，Anshun 561000，China;
　　2. College of Biotechnology，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang 212000，China;
　　3.College of Agriculture，Anshun University，Anshun 561000，China;
　　4.Chongqing Youliang Health Management Co.， Ltd，Chongqing 400000，China
　　Abstract：Object Selecte 25 kinds of traditional Chinese medicinal materials from guizhou， to study the antibacterial activity of 70% ethanolextract on common clinical pathogenic bacteria in vitro.Methods The traditional Chinese medicine powder was extracted by refluxing with 70% ethanol， and the bacteriostatic circle of the extract was measured by paper ingot AGAR diffusion method， and the minimum bacteriostaticconcentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） were determined bythe microfold dilution method. ResultsAmong the 25 kinds of alcohol extracts of guizhou traditional Chinese medicinal materials， 15 showed different degrees of bacteriostatic effects on n S. aureus and E. coli. Among them， Coptis chinensis Franch， Prunella vulgaris L， Rheum officinale Baill， Houttuynia cordata Thunb， Lysimachia christinae Hance have prominent antibacterial activities against the two pathogenic bacteria， with a bacteriostatic circle d ≥ 20 mm; The MIC of the two pathogens ranged from 7.82 mg/mL to 31.25 mg/mL. The MBC of the two pathogens ranged from 15.625 mg/mL to 62.50 mg/mL. Conclusion  Five kinds of guizhou Chinese medicinal materialswith strong antibacterial activity were screenedout， which provided certain scientific basis for the development of traditional Chinese medicine bacteriostatic agent and bacteriostatic daily chemical products.
　　Keywords：Chinese medicinal materials in guizhou;S.aureus; E. coli;MIC; MBC
　　大肠杆菌（Escherichia coli， EC）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， SA）现已成为世界上医院内常见的致病菌，被列为世界范围内最难解决的感染病菌之一[1-2]。大肠杆菌是哺乳动物小肠内的共生菌且广泛存在于生物体中。在人类中，大肠杆菌对肠道的感染部位分為肠外和肠内，主要通过被污染的食物经摄食进入体内而致病，引起急性腹泻、血压骤降以及人体脱水，肠道外感染会引发器官化脓等[3]。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，它可以使生物体内的器官局部化脓感染，严重的会引起肺炎、心包炎、肠炎和败血症等[4]。 　　由于全世界范围内抗生素的不合理的应用，细菌的耐药性对人类的危害变得越来越严重，人们把目标投向了来源广泛、安全性高、廉价易得、抗耐药机制独特的中药材[5-6]。贵州是中国中药资源大省，自古“黔地无闲草，夜郎多灵药”，特定的气候条件适宜多种药用植物的生长繁殖，且品质优良。本实验通过研究25种黔产中药材对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的体外抑菌作用，以期筛选出抗菌活性较强的黔产中药材，在天然中药材中找到解决耐药性问题的新途径。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 供试25种中药材均购于贵州省药材总公司。25种黔产中药材种名和科属见表1[7]。大肠杆菌（Escherichia coli， EC）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）由安顺学院农学院提供。氢氧化钠、氯化氢、氯化钠、无水乙醇，均为分析纯试剂（购自贵州博奥瑞杰生物科技有限公司）。SHP150型恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），XD2000A型旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司），SPDJ型净化工作台（上海浦东物理兴学化学仪器厂），LDZX50FB高压灭菌锅（上海中安医疗器械厂）。
　　1.2 药材醇提物的制备 称取30 g黔产中药材，粉碎并过筛，以10倍体积（W/V）70%乙醇300 mL，回流提取两次，每次1h，合并提取液，旋转蒸发仪浓缩，用70%乙醇溶解定容至30 mL，4℃冰箱内保存待测。注：100%药液浓度定义为1 g中药材浓缩至1 mL提取液的浓度。
　　1.3 培养基的配制 肉汤培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，加蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高压灭菌20 min。肉汤琼脂培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl：5 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1000 mL，pH7.2～7.4，121℃高压灭菌20 min。
　　1.4 供试菌种的活化和菌悬液的制备 分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接入无菌斜面培养基上进行活化，放入恒温培养箱37 ℃培养24 h，然后分别挑取活化好的1环菌种放入9 mL无菌肉汤培养基中，震荡摇匀。稀释成浓度约为0.1×108 CFU/mL的菌悬液，现用现配。
　　1.5 抑菌环的测定 将已灭菌的肉汤琼脂培养基倒入灭过菌的培养皿上（厚度为3 mm），用无菌棉签取浓度为0.1×108 CFU/mL标准细菌菌悬液均匀涂布于培养基。用无菌镊子夹取浸透黔产中药材提取物的纸锭（直径为6 mm）放在含菌培养基表面，以无菌70%乙醇浸透的纸锭作对照，37℃培养24h，重复3次，结果取平均值。
　　1.6 MIC的测定 采用倍比稀释法，取9支试管，于每管中先加入无菌肉汤培养基2 mL，然后于第1支试管中加入药液2 mL混匀后再取出2 mL混合液放入第2支试管中，混匀后取出2 mL加入第3支试管中，以此类推，直到第9支试管混匀后弃掉2 mL，使得稀释后各试管中的受试药液浓度倍比降低，最后取0.1 mL菌悬液分别加入上述的试管中混匀，37℃培养24 h后观察生长情况，受试药物重复3次。将透明的最低药液浓度定为最低抑菌浓度。
　　1.7 MBC的测定 将最低抑菌浓度以上的各浓度培养物分别取0.1 mL加到无菌肉汤琼脂培养基上，用涂布棒将菌液涂匀，37℃培养24 h后观察生长情况，重复3次。将无菌生长的最低药液浓度定为最低杀菌浓度。
　　2 结果与分析
　　2.1 25种黔产中药材醇提物的抑菌圈直径 通过纸锭琼脂扩散法测定提取物的抑菌圈。由表2可知，25种黔产中药材中黄连、黄柏、大黄、苦参、虎杖、金银花、鱼腥草、金钱草、夏枯草、厚朴、野菊花、川芎、金樱子、五味子、白芨等15种黔产中药材分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有不同程度的抑菌效果。连钱草、仙鹤草、紫珠、草赤芍、地骨皮、白芍、麦门冬、鸡矢藤等8种中药材对两种病原菌的抑菌效果均不明显。其中，黄连、夏枯草、大黄、鱼腥草、金钱草5种中药材均对两种病原菌的抑菌圈d≥20 mm，表明其抑菌效果最好，如图1所示。70%乙醇作为对照组抑菌圈不明显，表明其对实验结果没有影响。
　　2.2 25种黔产中药材醇提物对两种菌种的MIC 通过倍比稀释法对25种黔产中药材MIC测定。由表3可知，黄连、黄柏、大黄、苦参、虎杖、金银花、鱼腥草、金钱草、夏枯草、厚朴、野菊花、川芎、金樱子、五味子、白芨、地榆等16种黔产中药材对金黄色葡萄球菌的MIC范围在15.625 ～250 mg/mL之间。黄连、黄柏、大黄、苦参、虎杖、金银花、鱼腥草、金钱草、夏枯草、野菊花、厚朴、川穹、金樱子、五味子、白芨、透骨草等16种黔产中药材对大肠杆菌的MIC范围在7.82 ～250 mg/mL之间。其中，黄连、夏枯草、大黄、鱼腥草、金钱草5种中药材对两种标准菌株的MIC在7.82 ～31.25 mg/mL之间，表明其抑菌效果最好。
　　2.3 25种黔产中药材醇提物对两种菌种的MBC 由表4可知，黄连、黄柏、大黄、苦参、虎杖、金银花、鱼腥草、金钱草、夏枯草、厚朴、野菊花、川穹、金樱子、五味子、白芨、地榆等16种黔产中药材对金黄色葡萄球菌的MBC范围在31.25 ～1000 mg/mL之间。黄连、黄柏、大黄、苦参、虎杖、金银花、鱼腥草、金钱草、夏枯草、厚朴、野菊花、川芎、金樱子、五味子、白芨、透骨草等16种黔产中药材对大肠杆菌的MBC范围在15.625 ～1000 mg/mL之间。其中，黄连、夏枯草、大黄、鱼腥草、金钱草5种中药材对两种标准菌株的MBC范围在15.625 ～62.5 mg/mL之间，说明其杀菌效果最好。
　　3 讨论
　　 本研究通过查阅文献和医学古籍，总结临床医学经验[8-11]，采用体外抑菌活性实验，发现了15种黔产中药材分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有不同程度的抑菌效果。其中，黄连、大黄、鱼腥草、夏枯草、金钱草5种中药材对这两种病原菌均有较强的抑制作用。 　　 本实验只研究了25种黔产中药材对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，而现如今多种多样的致病性病原菌越来越广泛，致病菌耐药性问题较为严重，且传染性疾病对社会恐慌影响较大。在后期的研究过程中，课题组将会继续研究黔产中药材对其它致病性病原菌的抑菌机理和抗耐药性，希冀通过研发新型的“中药绿色抗生素”，解決致病菌耐药性问题，有助于合理深入开发利用贵州中药资源。
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　　（收稿日期：2020-11-16 编辑：刘 斌）
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