桑枝活性成分的提取及其抑菌和抗氧化作用

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　　 摘要：以桑枝作为原料，研究其乙醇提取物的抑菌活性和抗氧化活性。气相色谱-质谱分析结果表明，桑枝乙醇提取物的挥发性组分，主要由酯类（47.76%）、烷烃类（20.27%）、芳香烃类（15.84%）等化合物组成，GC含量最高的化合物是邻苯二甲酸二丁酯（41.20%），GC含量较高的化合物为十一烷（20.27%）。桑枝乙醇提取物的抑菌活性研究结果表明，桑枝乙醇提取物对大肠杆菌（Escherichia coli）具有较好的抑菌活性，抑菌圈直径为（11.77±0.54） mm。桑枝乙醇提取物的抗氧化活性研究結果表明，桑枝乙醇提取物50% DPPH自由基清除率质量浓度（IC50）为1.570 mg/mL，维生素C IC50为0.001 mg/mL。桑枝乙醇提取物50%羟基自由基清除率质量浓度（IC50）为68.437 mg/mL，维生素C IC50为7.082 mg/mL。桑枝乙醇提取物对DPPH自由基具有较好的清除作用。
　　 关键词：桑;气相色谱-质谱;乙醇提取物;抑菌活性;抗氧化活性
　　 中图分类号： R284 文献标志码： A
　　 文章编号：1002-1302（2020）07-0217-04
　　 桑（Morus alba）为桑科（Moraceae）桑属乔木或灌木，东北至西南各省区等均有栽培[1]。桑叶、桑椹为国家卫生部药食同源名录中的品种，桑白皮、桑枝为可用于保健食品名录中的品种[2-5]。桑枝中起主要药理活性作用的成分为桑枝多糖、黄酮类、生物碱类化合物，桑枝黄酮具有很强的抗氧化作用[6-10]。桑枝在食用菌、木醋液等行业领域应用方兴未艾[11-12]。桑种植园每年抚育间伐的桑枝资源丰富，高附加值桑枝的开发利用是桑枝加工利用亟待解决的问题之一。本研究以桑枝作为原料，研究其乙醇提取物的抑菌活性和抗氧化活性，通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，简称GC-MS）分析桑枝乙醇提取物的挥发性成分，以期为桑枝的开发利用提供基础数据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂与仪器
　　试验用桑枝采自黑龙江省齐齐哈尔市甘南林场的桑产业科技示范园，来源植物为桑科桑属桑的抚育间伐剩余物[13-15]。
　　供试菌种主要有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans），由东北林业大学实验室提供。
　　试验主要试剂有二苯基苦基肼自由基（DPPH·）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、水杨酸、无水乙醇、维生素C，均为分析纯。琼脂，由北京奥博星生物技术有限责任公司提供。
　　试验主要仪器有索氏提取装置（自制）、RE-2000A 型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）、722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 桑枝乙醇提取物的制备
　　采用索氏提取装置，溶剂为无水乙醇。桑枝粉碎过筛，取10 g桑枝粉末（≤0.425 mm），用滤纸包好并用细线扎紧后放入滤筒内，圆底烧瓶中加入100 mL无水乙醇，放入水浴锅内，连接好索氏提取装置各部分，接通冷凝水，索氏提取5 h，制得桑枝乙醇提取液。温度设为50 ℃，大气压强为0.1 MPa，转速为35 r/min，用旋转薄膜蒸发法除去无水乙醇，制得桑枝乙醇提取物。
　　1.2.2 桑枝乙醇提取物的GC-MS分析
　　将桑枝乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪对试样进行分析。色谱分析条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;FID检测器;初始温度为40 ℃（保持2 min），以10 ℃/min的升温速率升到280 ℃（保持2 min）;进样口温度为250 ℃;进样量为1.0 μL;不分流，氦气载气，流速为1 mL/min。质谱分析条件：EI电离源，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围30～500 u。
　　1.2.3 桑枝乙醇提取物的抑菌活性
　　采用滤纸片法测定桑枝乙醇提取物的抑菌活性[16-18]。分别取活化培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）、白色念珠菌（C. albicans）置于液体培养基中，在37 ℃恒温摇床中培养24 h，再配制成浓度为106～107 CFU/mL 的菌悬液，用移液枪吸取已活化好的菌悬液20 μL，将其均匀涂抹在冷却后的琼脂平板表面，制成含菌平板。取浸泡过10 mg/mL桑枝提取物的干燥6 mm圆形滤纸片，贴在上述制好的含菌平板上，每个培养皿（直径为90 mm）贴上3片浸过同一种质量浓度溶液的滤纸片（滤纸片尽量间隔相同），以不含药滤纸片作为空白对照。把处理过的含菌平板置于恒温箱中（温度控制在37 ℃），培养24 h，用十字交叉法测定抑菌圈直径。
　　1.2.4 桑枝乙醇提取物的抗氧化活性
　　1.2.4.1 样品溶液的配制
　　称取1 g桑枝乙醇提取物，加入100 mL无水乙醇充分溶解，得到10 mg/mL 的样品母液，用移液管准确移取体积为0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL的母液，定容，至10 mL容量瓶中，得到0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mg/mL的样品溶液。
　　1.2.4.2 DPPH自由基清除率测定
　　精确称取0.02 g DPPH样品，加入无水乙醇定容至500 mL容量瓶中，得到质量浓度为0.04 mg/mL的DPPH溶液。向DPPH溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析[19-22]。称取1 g维生素C，加入1 000 mL 水定容为1 mg/mL标准溶液，分别取2、4、6、8 mL溶液于10 mL容量瓶中定容，作为标准液待用。分别取2 mL不同浓度的样品溶液及标准液，加入2 mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30 min后，于517 nm处测吸光度（D1），用无水乙醇替代样品溶液测定吸光度（D0），用无水乙醇替代DPPH溶液测定吸光度（D2）。平行操作3次，样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算： 　　DPPH自由基清除率=[JB（（]1-[SX（]D1-D2D0[SX）][JB））]×100%。
　　1.2.4.3 羟基自由基清除率测定
　　在Fenton反应中，检测木醋液对羟基自由基的清除作用，过氧化氢和铁离子混合产生羟基自由基，在体系内加入水杨酸产生有色物质，该物质在510 nm波长处有最大吸收波长[23-24]。称取2 g维生素C，加入1 000 mL水定容为2 mg/mL标准溶液，分别取1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL溶液于10 mL容量瓶中定容，作為标准液待用。向试管中依次加入1 mmol/L FeSO4溶液1 mL、不同浓度样液或标准液1 mL，1 mmol/L H2O2 1 mL，3 mmol/L水杨酸溶液1 mL混匀，室温下放置30 min，于510 nm波长处测定吸光度（Dx），用蒸馏水代替水杨酸测定吸光度（D0），用蒸馏水代替样液测定吸光度（Dx0）。平行操作3次，取平均值。根据下式计算试样对羟基自由基的清除率：
　　1.3 数据计算与处理
　　采用Excel 2007、SPSS 19.0软件进行数据统计分析、处理，数据均以均值±标准差表示。
　　2 结果与分析
　　2.1 桑枝乙醇提取物的GC-MS分析
　　 采用索氏提取法，以无水乙醇作为溶剂，提取得到的桑枝乙醇提取物为黄色透明黏稠油状液体，提取得率为12%。由桑枝乙醇提取物样品的总离子流色谱（图1）可知，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，总GC含量的83.87%的化合物被鉴定，共鉴定出4种化合物，桑枝乙醇提取物的GC-MS分析结果如表1所示。
　　 由表1可知，桑枝乙醇提取物的挥发性组分，主要由酯类（47.76%）、烷烃类（20.27%）、芳香烃类（15.84%）等化合物组成，GC含量最高的化合物是邻苯二甲酸二丁酯（41.20%），GC含量较高的化合物为十一烷（20.27%）。
　　2.2 桑枝乙醇提取物的抑菌活性分析
　　由表2可知， 桑枝乙醇提取物对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）、白色念珠菌（C. albicans）均有抑制作用。桑枝乙醇提取物对3种菌的抑制作用表现为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>白色念珠菌，对大肠杆菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径达到（11.77±0.54） mm，提取物对3种菌的抑制作用有显著性差异，具有统计学意义。
　　2.3 桑枝乙醇提取物的抗氧化活性分析
　　2.3.1 桑枝乙醇提取物对DPPH自由基的清除作用
　　从图2中可以看出，桑枝乙醇提取物对DPPH自由基有较强的清除作用，且随着质量浓度增大，清除效果呈增加趋势，在质量浓度较低时，清除效果随浓度升高表现增强趋势较快，当浓度升高到一定程度时，曲线趋势变平缓。试验中最小质量浓度为1 mg/mL，最大质量浓度为10 mg/mL时，DPPH自由基清除率达87.62%，在本试验条件下，维生素C清除50% DPPH自由基质量浓度（IC50）为0.001 mg/mL，桑枝乙醇提取物清除50% DPPH自由基质量浓度（IC50）为1.570 mg/mL。拟合回归方程为y=22.37lnx+39.50（r2=0.98）。图3为维生素C对DPPH自由基的清除率，桑枝乙醇提取物对DPPH自由基的清除效果较维生素C弱。由于维生素C清除DPPH自由基的效果明显，当维生素C质量浓度为时，对自由基清除率与桑枝乙醇提取物质量浓度为10 mg/mL时的清除率相当，本试验中维生素C的最低质量浓度清除率依然高于桑枝乙醇提取物最大质量浓度的清除率，桑枝乙醇提取物对DPPH自由基的清除作用比较明显，抗氧化效果较好。
　　2.3.2 桑枝乙醇提取物对羟基自由基的清除作用
　　由图4可知，桑枝乙醇提取物对羟基自由基清除效果不明显，且随质量浓度增大，清除效果并没有明显的增强趋势，在质量浓度为7.5 mg/mL时，清除率最高为18.26%，在本试验条件下，维生素C清除50%羟基自由基质量浓度（IC50）为7.082 mg/mL，然而桑枝乙醇提取物对羟基自由基清除率未达到50%，拟合回归方程为y=2.09lnx+13.57（r2=0.45）。图5为维生素C对羟基自由基的清除作用，桑枝乙醇提取物对羟基自由基的清除效果较维生素C弱。通过计算得出，当维生素C质量浓度为1.522 mg/mL时，其羟基自由基清除率为20%，桑枝乙醇提取物质量浓度为10 mg/mL时对羟基自由基的清除率与维生素C相当。桑枝乙醇提取物50%羟基自由基清除率质量浓度（IC50）为68.437 mg/mL。
　　3 结论
　　以桑枝作为原料，研究其乙醇提取物的抑菌活性和抗氧化活性。气相色谱-质谱分析结果表明，桑枝乙醇提取物的挥发性组分，主要由酯类（47.76%）、烷烃类（20.27%）、芳香烃类（15.84%）等化合物组成，GC含量最高的化合物是邻苯二甲酸二丁酯（41.20%），GC含量较高的化合物为十一烷（20.27%）。桑枝乙醇提取物的抑菌活性研究结果表明，桑枝乙醇提取物对大肠杆菌（E. coli）具有较好的抑菌活性，抑菌圈直径为（11.77±0.54） mm。桑枝乙醇提取物的抗氧化活性研究结果表明，桑枝乙醇提取物50% DPPH自由基清除率质量浓度（IC50）为1.570 mg/mL，维生素C IC50为0.001 mg/mL。桑枝乙醇提取物50%羟基自由基清除率质量浓度（IC50）为68.437 mg/mL，维生素C IC50为7.082 mg/mL。桑枝乙醇提取物对DPPH自由基具有较好的清除作用。抗氧化作用试验主要为清除自由基，选择以1～10 mg/mL质量浓度测定桑枝乙醇提取物的抗氧化活性，并在1～10 mg/mL范围内设立了7个质量浓度梯度，测定桑枝乙醇提取物的清除自由基能力。结果表明，桑枝乙醇提取物具有较强的抗氧化作用，且随着浓度增大，抗氧化效果增强，其抗氧化效果对DPPH自由基作用优于羟基自由基，桑枝乙醇提取物质量浓度为10 mg/mL 时，对DPPH自由基的清除率达87.62%。桑枝乙醇提取物中黄酮类化合物的分离、鉴定及其抗氧化作用，有待进一步研究。桑枝提取物作为天然抑菌剂、抗氧化剂，在药品、化妆品行业具有较好的开发潜力。 　　参考文献：
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