球菊的抗氧化活性成分研究
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摘要 通过醇提法提取新鲜球菊抗氧化性有效成分。以芦丁为参照品、硝酸铝为显色剂测定黄酮含量。通过测定三价铁离子的还原能力和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率检测黄酮的抗氧化活性。结果表明，当固液比为1∶35时，用95 %乙醇在50 ℃条件下浸提球菊4 h时，黄酮含量达到最高（7.61 mg/g）;球菊醇提物对Fe3+有较强的还原能力，并能够较好地清除DPPH自由基。本研究结果可为今后开发球菊抗氧化活性成分提供参考。
关键词 球菊;黄酮;抗氧化活性成分
Abstract The antioxidant effective components of fresh Epaltes australis Less. were extracted by the method of ethanol extraction.The flavonoid content was determined by using rutin as reference material and aluminum nitrate as color reagent.The antioxidant activity was detected by measuring the reducing ability of Fe3+ and the radical scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH）.The results showed that the flavonoid yield was the highest （7.61 mg/g） when solid-liquid ratio was 1∶35 and immersed in 95% ethanol at 50 ℃ for 4 h;the ethanol extraction of Epaltes australis Less. had a strong reducing ability to Fe3+ and the DPPH free radical could be eliminated well. The results of this study provide references for the future development of antioxidant effective components of Epaltes australis Less.
Key words Epaltes australis Less.;flavonoid;antioxidant effective component
球菊（Epaltes australis Less.）是被子植物门菊科球菊属的一年生草本植物，广泛分布于印度、泰国、中南半岛、马来西亚至澳大利亚等地及中国台湾、福建、广东及其南部沿海岛屿、广西及云南等地[1]。菊科植物主要化学成分为黄酮、多酚、多糖及挥发油等，具有广泛的药理作用，其主要活性物质为黄酮类化合物，该化合物含量的高低可作为评价其药用价值的主要标志[2-6]。菊科植物具有显著的抗氧化特性，是一类具有开发前景的天然药物。虽然菊科植物的抗氧化活性已有很多研究报道[7-9]，但是球菊的抗氧性研究鲜少报道。本文通过对球菊抗氧化活性的研究，分析总黄酮含量及其对DPPH自由基的清除能力，以期為今后开发球菊抗氧化活性成分提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为球菊，购于花店;芦丁标准品（HPLC≥98%），由上海源叶生物科技有限公司生产;亚硝酸钠、无水乙醇、95%乙醇、磷酸氢二钠、氢氧化钠和磷酸一氢钠均购于西陇科学股份有限公司;硫酸铝、铁氰化钾、三氯乙酸和三氯化铁均购于国药集团化学试剂有限公司;75%乙醇购于佳林漓峰医药用品有限责任公司;1，1二苯基-2-三硝基苯（含量10%～20%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;85%乙醇为自配;去离子水为自制。
1.2 仪器与设备
真空干燥箱（DZF-6021型），上海精宏实验设备有限公司生产;离心机（TGL-16G型），上海安亭科学仪器厂生产;紫外可见分光光度计（UV-1800型），上海奥析科学仪器有限公司生产;电子天平（FA1104型），上海良平仪器仪表有限公司生产;集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S型），河南予华仪器有限公司生产;旋转蒸发仪（RE-52AA型），上海亚荣生化仪器厂生产;SHZ-D循环水式多用循环泵，巩义市英峪高科仪器厂生产。
1.3 试验方法
1.3.1 黄酮含量的测定。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH可见分光光度法测定球菊中总黄酮含量[10]。其基本原理为黄酮类化合物在碱性条件下与Al（NO3）3和NaNO2发生络合显色反应。
（1）绘制芦丁标准曲线。精密称取芦丁标准品50 mg于25 mL容量瓶中，加入适量无水乙醇溶解，置水浴中加热辅助溶解，放冷，稀释至刻度摇匀。精确量取10.0 mL置于100 mL容量瓶，用蒸馏水定容，摇匀，作为芦丁标准溶液使用。分别取芦丁标准溶液0.5、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，分别加入25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至12.0 mL，再分别加入5% NaNO2溶液1.0 mL，放置6 min，接着加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，放置6 min，再加入4% NaOH溶液10.0 mL，放置15 min，加蒸馏水定容至25 mL、摇匀。以空白组（不加显色剂）为参比溶液，在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。 （2）乙醇浸提法提取球菊黄酮。将球菊样品置于烘箱中干燥，然后粉碎。精密称取球菊干燥粉末1.0 g，加入一定的乙醇，浸泡一段时间之后将样品溶液离心分离。取上清液并在一定温度下进行浓缩，将浓缩液用乙醇定容至25.0 mL。精密吸取1.0 mL待测液，测定吸光度A。对照芦丁标准曲线计算黄酮化合物得率[11]。计算公式如下：
黄酮化合物的含量（mg/g）=C×V1×V3 /（W×V2）
式中：C为从标准曲线中得到样品中黄酮类物质浓度;V1为提取液总体积（mL）;V2为测定取量体积（mL）;V3为显色定容反应定容体积（mL）;W为样品质量（g）。
（3）黄酮含量的影响因素。①时间对黄酮含量的影响。当球菊与75%乙醇的固液比为1∶25时，在50 ℃条件下分别浸泡球菊2、3、4、5 h，得到球菊醇提物，测定吸光度。②温度对黄酮含量的影响。分别在40、50、60、70 ℃条件下按球菊与75%乙醇的固液比为1∶25浸泡球菊4 h，得到球菊醇提物，测定吸光度。③固液比对黄酮含量的影响。在50 ℃条件下，将球菊粉末与75%酒精按固液比为1∶25、1∶30、1∶35、1∶40浸泡球菊4 h，提取黄酮，测定吸光度。④乙醇浓度对黄酮含量的影响。在50 ℃条件下，按球菊粉末与乙醇固液比为1∶35，分别用75.0%、85.0%、95.0%、99.9%的乙醇浸泡球菊4 h，提取黄酮，测定吸光度。
1.3.2 黃酮对DPPH自由基的清除作用研究。精密称取4.0 mg DPPH粉末，加50 mL无水乙醇溶液溶解，定容至100 mL，作为储备液，放在避光处保存。将提取出的黄酮浸膏溶解，配制不同浓度的溶液，作为待测液，研究黄酮对DPPH自由基的清除作用[12]。
（1）测光吸收值A1。取待测液1 mL于5 mL离心管中，并加入DPPH溶液3 mL，混合均匀，在室温下离心20 min（3 500 r/min），取适量上清液在517 nm处测定光吸收值A1。
（2）测光吸收值A2。取待测液1 mL于5 mL离心管中，并加入无水乙醇3 mL，然后在室温下离心20 min（3 500 r/min），取适量上清液在517 nm处测光吸收值A2。
（3）测光吸收值A0。取无水乙醇溶液1 mL于5 mL离心管中，并加入DPPH溶液3 mL，然后在室温下离心20 min（3 500 r/min），取适量上清液在517 nm处测定光吸收值A0。
式中，E（DPPH）为总黄酮提取液对DPPH自由基的清除率（%）;A0为DPPH溶液与无水乙醇反应后的吸光度;A1为DPPH溶液+总黄酮提取液的吸光度;A2为无水乙醇+总黄酮提取液的吸光度。
1.3.3 黄酮还原能力的测定。分别取5支10 mL比色管，依次加入不同浓度的待测液2.5 mL磷酸盐缓冲液（2.0 mol/L，pH值为6.6）2.5 mL和1%铁氰化钾2.5 mL，混匀后置于50 ℃水浴反应20 min，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混匀，离心（3 500 r/min）。取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL于试管内混匀，再在700 nm处测定吸光度值[13]。试验重复3次。若吸光度越大，则还原能力越强，物质的还原能力与其抗氧化能力有显著相关性。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线的测定
由图1可知，根据标准曲线获得线性回归方程为y=14.386x-0.188 7，R2=0.991 5，表明芦丁的吸光度与浓度成良好的线性关系。
2.2 不同因素对黄酮含量的影响
2.2.1 浸泡时间对黄酮含量的影响。由表1可知，球菊与75%乙醇按固液比为1∶20，并在50 ℃条件下浸泡，不同浸泡时间，黄酮含量不同。当浸泡2～4 h时，球菊中黄酮含量随时间的延长而增大，其中浸泡时间为4 h时黄酮含量最高（6.15 mg/g）;但随时间的延长（5 h），黄酮提取率有所降低。可能是由于浸泡时间长，球菊所含黄酮发生氧化生成醌，导致球菊黄酮含量降低。
2.2.2 不同温度对黄酮含量的影响。当球菊和75%乙醇按固液比为1∶20于40～70 ℃浸泡4 h时，其黄酮含量如表2所示。当温度为40～50 ℃时，黄酮含量随温度的升高而增大，其中温度为50 ℃时黄酮含量最高（6.15 mg/g）;但随温度的升高（60～70 ℃），黄酮含量减少，可能是由于温度高会加速黄酮的氧化，导致球菊黄酮提取率降低。
2.2.3 不同固液比对黄酮含量的影响。当固液比为1∶20～40，在50 ℃条件下浸泡球菊4 h时，其黄酮含量如表3所示。当固液比为1∶20～35时，黄酮含量随提取溶剂量的增大而增大，且当固液比为1∶35时黄酮含量最高（6.63 mg/g）。但随提取剂用量继续增大，球菊中黄酮含量降低。
2.2.4 不同乙醇浓度对黄酮含量的影响。当固液比为1∶35，用75%～100%乙醇在50 ℃条件下浸泡球菊4 h时，其黄酮含量如表4所示。当乙醇浓度为75%～95%时，黄酮含量随乙醇浓度的升高而增大，其中用95%提取时黄酮含量最高（7.61 mg/g）;而后随乙醇浓度的升高（100%），黄酮含量有所下降，可能是由于所用溶剂的极性减小，导致球菊的部分黄酮溶解度降低。
2.3 黄酮对DPPH清除作用的影响
由表5可知，加入等量体积（3 mL）的DPPH后，当样品液浓度为0.5～4.0 mg/mL时，吸光度A1随样品溶液浓度增加而减小。当样品液浓度为2.5 mg/mL时，继续加大样品浓度，吸光度A1减小的幅度变小。说明黄酮浓度的升高有利于清除DPPH自由基，当清除到一定程度时，降低黄酮浓度，清除DPPH自由基的能力下降。当待测液加入等量体积（3.0 mL）的无水乙醇后，样品液浓度为1.5～4.0 mg/mL时，吸光度A2大致呈现增大的趋势;而在0.5～1.5 mg/mL时，可能由于样品浓度过小和仪器系统误差导致反常的结果，但是数值变动非常小。 由图2可知，在加入等量体积（3 mL）的DPPH自由基后，当样品液浓度为0.5～4.0 mg/mL时，黄酮对DPPH清除率均呈现上升的趋势，而当样品液浓度为2.5 mg/mL时，继续加大样品浓度，其对DPPH的清除率变动的幅度不大。由此表明，随着黄酮浓度的升高，其对DPPH自由基的清除率能力也会增强。
2.4 黄酮对Fe3+还原能力的测定
由表6可知，在加入等量体积Fe3+后，样品液浓度为0.5～5.0 mg/mL时，随着样品液浓度的增加吸光度会呈增大的趋势。由此表明，球菊中黄酮类化合物对Fe3+有较好的还原能力。
3 结论与讨论
試验结果表明，当固液比为1∶35时，用95 %乙醇在50 ℃条件下浸提球菊4 h时，其黄酮含量达到最高（7.61 mg/g）;球菊醇提物对Fe3+有较强的还原能力，同时也能够较好地清除DPPH自由基。本研究结果可为今后开发球菊抗氧化活性成分提供科学参考。
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