核桃楸外果皮三萜类物质的提取及抑菌活性

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　　摘 要：为探讨核桃楸外果皮三萜类物质提取方法的响应面优化，研究其抑菌活性，本文采用超声辅助的乙醇溶剂提取法提取核桃楸外果皮三萜类物质，并利用响应面法优化其提取工艺。在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合法设计多因素试验，分析乙醇体积分数、超声时间和液料比对三萜类物质提取率的影响，确定最佳提取条件。此外，进一步研究三萜类物质对黄孢原毛平革菌（白腐真菌）和绿色木霉菌的抑菌活性。结果表明：核桃楸外果皮三萜类物质的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数为80%、超声时间为44 min、液料比为19∶1（mL/g），此时核桃楸外果皮三萜类物质的提取率为2.62 mg/g。抑菌实验表明，核桃楸外果皮三萜类物质对黄孢原毛平革菌（白腐真菌）和绿色木霉菌均具有抑菌效果，最大抑菌圈直径分别达到18.43 mm和18.92 mm。本研究表明核桃楸外果皮三萜类提取物具有良好的抑菌活性，为核桃楸外果皮的开发和研究提供参考。
　　关键词：核桃楸;三萜类物质;超声提取;响应面;抑菌活性
　　Abstract：To optimize the extraction method of triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica Maxim by response surface， and to study its antibacterial activity， ultrasound-assisted ethanol extraction was used to extract the triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica， and the extraction process was optimized by response surface methodology （RSM）. On the basis of single factor experiment， the optimal extraction conditions were explored through Box-Behnken central composite design， studying the effects of ethanol volume fraction， ultrasonic time and liquid-to-material ratio on the extraction rate of triterpenoids. In addition， the antibacterial activities of triterpenoids against Phanerochaete chrysosporium Burdsall and Trichoderma viride were further studied. The results showed that the optimal extraction conditions of triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica were： ethanol volume fraction 80%， ultrasonic time 44 min， liquid to material ratio 19∶1， and extraction rate was 2.62 mg/g. The bacteriostasis test showed that the triterpenoids of the green peel of Juglans mandshurica had antibacterial activities against Phanerochaete chrysosporium Burdsall and Trichoderma viride， the maximum inhibition zone diameter was 18.43 mm and 18.92 mm respectively. This study showed triterpenoids in the green peel of Juglans mandshurica had good bacteriostatic activity and provided a reference for the development and research of the green peel of Juglans mandshurica.
　　Keywords：Juglans mandshurica Maxim; triterpenoid; ultrasonic extraction; response surface; antibacterial activity
　　0 引言
　　核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）是胡桃科、胡桃屬植物，落叶乔木，主要分布于我国东北、华北和河北等地区，是东北三大硬阔树种之一，是一种前景广阔的木本油料植物。核桃楸是我国十分重要的药源植物，其树皮、树叶及成熟的果实与果皮均可入药，均有显著的抗菌、消炎、抗氧化以及抗癌等作用[1-3]。近年来研究发现，核桃楸的不同部位均具有一定的药用价值，核桃楸外果皮的主要化学成分包括黄酮类、鞣质类、生物碱、萜类及强心苷等活性物质[4-7]。萜类是三大次生代谢产物之一，在自然界分布广泛，尤其存在中国的传统天然药物中，具有广泛的药理作用和重要的生物活性[8-10]。萜类物质是指具有（C5H8）n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，可以看成是由异戊二烯或异戊烷以各种方式连结而成的一类天然化合物，可分为单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜及多萜化合物等[11]。其中三萜类化合物作为一类重要的天然化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、调节血糖、降血压和抗肿瘤等作用[12]。相关人员对核桃楸的研究主要集中对黄酮类、醌类、酚类、挥发油和多糖类等化学成分及其生物活性的研究，有关核桃楸外果皮的三萜类物质提取和应用尚鲜有报道。本实验以熊果酸为标准品，采用超声辅助的乙醇溶剂提取法提取核桃楸外果皮三萜类物质，运用响应面法对其提取工艺进行优化，并探讨核桃楸外果皮三萜类物质对黄孢原毛平革菌（白腐真菌）和绿色木霉菌的抑菌活性。 　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料与仪器
　　材料：核桃楸外果皮，采于2017年东北林业大学实验林场;黄孢原毛平革菌（白腐真菌）（Phanerochaete chrysosporium）和绿色木霉菌（Trichoderma viride）均由东北林业大学工程技术学院实验室提供。试剂：熊果酸标准品，优级纯（阿拉丁试剂）;乙醇、冰乙酸、香草醛和高氯酸均为分析纯。仪器：RE-2000 A旋转蒸发仪，KQ 3200 DE型数控超声波清洗器，TU-1901型紫外分光光度计，800型电动离心机，BS-224-S电子天平，DHG 9145 A电热恒温鼓风干燥箱。
　　1.2 实验方法
　　称量5 g核桃楸外果皮粗粉，溶于乙醇溶液里超声提取，抽滤离心后得到乙醇粗提溶液。将其减压旋转蒸发后，加入水、氯仿和甲醇各100 mL，体积比为1∶1∶1，进行萃取，分离留下氯仿液。将其减压旋转蒸发后，加入50 mL无水甲醇溶液，得到三萜类物质提取液。
　　1.2.1 单因素法探究提取条件
　　采用单因素法，分别探究乙醇体积分数、超声时间和液料比对三萜类物质提取率的影响，得到各因素最佳提取条件。控制超声时间40 min和液料比15∶1不变，比较不同乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%条件下三萜类物质的提取率;控制乙醇体积分数80%和液料比15∶1不變，比较不同超声时间20、30、40、50、60 min下三萜类物质的提取率;控制乙醇体积分数80%和超声时间40 min不变，比较不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1条件下三萜类物质的提取率[13]。
　　1.2.2 响应面优化试验
　　在单因素实验的基础上，运用Design-Expert软件，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理选取影响三萜类物质提取的3个因素：乙醇体积分数、超声时间和液料比进行响应面优化组合[14]，表1为因素水平设计表。
　　1.3 测定方法
　　1.3.1 熊果酸标准溶液曲线的绘制
　　精密称取10 mg熊果酸标准样品，溶于无水甲醇中，定容至50 mL，摇匀制成浓度为0.2 mg/mL的熊果酸标准品溶液。吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL熊果酸标准品溶液分别置于试管中，水浴蒸干，滴加0.4 mL的5 %香草醛醋酸溶液和1.6 mL高氯酸溶液，在65 ℃水浴加热15 min，取出冷凝水冲凉至室温，加5 mL冰醋酸摇匀后静置，在最大吸收峰548 nm处测定吸光度[13]，绘制标准曲线得到回归方程为：
　　A = 36.573c + 0.378。
　　式中：A为吸光度;c为标准品熊果酸的浓度，mg/mL。决定系数R2 = 0.999。
　　1.3.2 三萜类物质的含量测定
　　精确抽取1 mL甲醇溶液于试管中，进行上述标准品的定性鉴定，在最大吸收峰548 nm处测定吸光度A，将其代入标准曲线回归方程中，即可得到三萜类物质含量。
　　1.3.3 三萜类物质的抑菌实验
　　将已高温灭菌的PDA培养基倒入培养皿中冷却凝固，用接种针取适量白腐真菌或绿色木霉菌放入盛有玻璃珠和蒸馏水的试管中，剧烈震荡试管打散菌丝。取棉签轻轻蘸取试管中的白腐真菌或绿色木霉菌菌液10～20次均匀涂在培养基上，待用。将核桃楸外果皮三萜类提取原液用无水甲醇稀释至浓度分别为44、22、11、5.5 μg/mL的一系列三萜类提取液，及空白对照样无水甲醇。用打孔器依次在培养基上打出5个孔，将溶液按照浓度打入孔中，平行3次。置于恒温恒湿培养箱中培养，每天观察生长情况，通过十字交叉法用游标卡尺测量孔内径，记录抑菌圈直径，比较抑菌作用的大小，计算抑菌效率[15-16]。
　　2 结果与分析
　　2.1 单因素实验结果分析
　　单因素实验结果如图1所示。由图1（a）可以看出，三萜类物质提取率随乙醇体积分数的增大呈现先上升后下降的趋势，当乙醇体积分数达到80%时，提取率达到最大值。此时继续增加乙醇体积分数，提取率反而下降，因为乙醇体积分数过高，溶剂的极性降低，一些醇溶性杂质和极性比较小的成分溶出，阻碍目标活性成分的溶出，导致提取率下降。
　　由图1（b）可以看出，三萜类物质提取率随超声时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，当超声时间为40 min时，提取率达到最大值。原因是延长超声时间，提取液的温度上升，使三萜类物质的溶出量增多;但当超声时间过长，提取液的温度过高，导致部分三萜类物质被分解，结构被破坏，从而使提取率下降。
　　由图1（c）可以看出，三萜类物质提取率随料液比的增大呈现先上升后缓慢下降的趋势，当液料比为15∶1时，提取率达到最大值。主要是由于提取溶剂用量的增加提高了核桃楸外果皮原料与溶剂间三萜类物质的浓度差，有利于其从原料向溶剂中扩散，提高提取率;当大部分活性物质已经渗出时，再增加液料比，提取率反而下降，可能是需要蒸发浓缩的时间更久，三萜类物质结构被破坏，考虑成本，选择15∶1 mL/g[17]。
　　2.2 响应面结果分析与优化
　　2.2.1 响应面优化设计模型的建立
　　在单因素实验结果的基础上，对提取核桃楸外果皮三萜类物质进行三因素三水平响应面优化组合，表2为优化响应面方案设计及试验结果。
　　2.2.2 回归方程与方差分析
　　通过Design Expert对结果数据进行多项回归拟合分析，建立提取率（Y）与乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、液料比（C）的线性回归方程：
　　回归模型的方差分析显示，P<0.000 1，说明该模型具有显著性，且差异极显著（P<0.01）。决定系数R2=0.975 7，修订系数R2Adj=0.944 5，说明该模型拟合度较好，试验误差小[18]。信噪比为13.895>4，说明该模型响应信号强，回归方程拟合度好，可进行真实值的分析和预测试验结果。变异系数（C.V）=8.23，说明该模型可重复。一次项C和二次项A2、B2、C2对三萜类物质提取率的影响是极显著的;一次项A、B对三萜类物质提取率的影响是显著的;交互项AC交互影响存在显著关系，其他交互影响均不存在显著性差异。三因素对三萜类物质提取率的影响大小顺序为：液料比（C）、乙醇体积分数（A）、超声时间（B）。 　　2.2.3 等值线图和响应面图分析
　　 利用Design Expert对结果数据进行分析，乙醇体积分数、超声时间和液料比选取一个因素固定，其他两因素及其交互作用对三萜类物质提取率的等值线图和响应面图如图2所示。
　　模型中A、B、C，其中两个因素固定在0水平，得到另外一个因素对三萜类物质提取率的子模型。由图2可以看出，乙醇体积分数（A）和超声时间（B）、乙醇体积分数（A）和液料比（C）、超声时间（B）和液料比（C）对三萜类提取率的交互作用。响应面坡陡峭程度和等高线形状反映出交互作用的强度，如果响应面坡度相对平缓，则说明受提取因素变化的影响不大;相反，如果坡度比较陡峭，则说明响应面值受提取因素变化的影响较大。若等高线呈椭圆形，表明两两因素相互效应明显，呈圆形则反之[19]。图2中3个响应面图均为平滑的曲面，且开口向下，说明最大响应值就存在于曲面上，且在所设计的因素水平范围内能够找到最佳工艺条件。
　　由Design Expert软件进一步对工艺参数进行最优化分析，得到提取的最佳工艺参数为：乙醇体积分数为82.48%、超声时间为44.45 min、液料比为19.42∶1 mL/g，预测值为2.67 mg/g。考虑到试验的可操作性，将修正为：乙醇体积分数为80%、超声时间为44 min、液料比為19∶1 mL/g，重复三次验证试验。按上述修正后的条件进行提取，得到三萜类物质的平均提取率为2.62 mg/g，与预测值的相对误差为1.87%，说明模型可靠，提取效果理想。王占一等[13]从石榴皮中超声波辅助提取三萜类化合物，并通过响应面试验优化工艺条件，提取率大大提升为0.563%。本实验采用超声辅助的乙醇溶剂提取法提取核桃楸外果皮三萜类物质，在单因素实验确定每个影响因素的最佳值后，利用响应面法进一步优化其提取工艺条件，提取结果与响应面模型预测值相差不大，验证了提取工艺可行。
　　2.3 三萜类物质抑菌效果分析
　　用外果皮三萜类物质提取液处理后，观察到白腐真菌和绿色木霉菌均从第4天开始生长（图3），其中1、2、3、4分别代表浓度为44、22、11、5.5 μg/mL的三萜类提取液，5代表空白对照。之后每天测量产生抑菌圈直径的大小，其直径变化情况如图4和图5所示。
　　核桃楸外果皮三萜类物质提取液的抑菌活性实验证明，其对白腐真菌和绿色木霉菌均有较明显的抑菌活性。由图4可知，在白腐真菌生长的4～9 d中，
　　同理，由图5可知，只有5.5 μg/mL的三萜类物质提取液几乎和空白对照样的抑菌圈直径相同，其他浓度提取液的抑菌性远比空白样强，并且抑菌效果与提取液浓度有关。在试验的浓度范围内，抑菌性与萜类提取物浓度呈正相关。其中44 μg/mL的三萜类物质提取液最大抑菌圈直径为18.92 mm，最小抑菌圈直径为12.61 mm，间隔时间为5 d，其抑菌效率为1.26 mm/d。
　　三萜类物质具有较强的抑菌性。刘高强等[20]检测出赤芝菌体三萜化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均具有显著抑制作用。本实验中三萜类物质提取液对白腐真菌和绿色木霉菌产生的抑菌圈直径随着时间先下降后趋于稳定，其中在前3 d下降最快，抑菌效果最佳。可能是由于培养的菌种进入了对数生长期，生长速率较快，抑菌圈直径变化较大[21]。推测三萜类物质具有抑菌性的原因为其可以破坏菌种结构，扰乱菌种生长周期，抑制目标菌细胞内的糖类及代谢中间产物的氧化脱氢过程，同时降低细胞内酶的活性，甚至是直接抑制细胞内核酸分子合成，从而达到使细胞凋亡，进而达到杀灭细菌的目的[22]。三萜类物质提取液对白腐真菌和绿色木霉菌的抑菌效果与提取液浓度成正比，浓度越大，抑菌效果越好，具有较好的抑菌活性。由此可见，核桃楸外果皮具有良好的生物活性，可以进一步开发其更多的综合利用价值。
　　3 结论
　　在单因素实验的基础上，采用超声辅助的乙醇溶剂提取法提取核桃楸外果皮三萜类物质，利用响应面法在三因素三水平的设计下，优化提取工艺条件，得到各因素的主要影响关系由大到小顺序为：液料比、乙醇体积分数、超声时间。最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数为80%、超声时间为44 min、液料比为19∶1，最大提取率可达到2.62 mg/g。与响应面预测值2.67 mg/g的相对误差为1.87%，说明模型可靠，提取效果理想。核桃楸外果皮三萜类物质对黄孢原毛平革菌（白腐真菌）和绿色木霉菌均具有一定的抑菌效果，最大抑菌圈直径分别达到18.43 mm和18.92 mm，但受提取液浓度影响较大，提取液浓度越小，抑菌效果越不明显。
　　我国核桃楸资源丰富，关于三萜类活性物质的研究报道较少。本文说明核桃楸外果皮三萜类物质的提取工艺切实可行，并具有一定的抑菌作用，为其进一步开发利用提供参考。
　　【参 考 文 献】
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