黄连中盐酸小檗碱的提取纯化及抑菌活性研究

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　　摘要 为了探究盐酸小檗碱在植物病原真菌方面的抑制作用，以黄连根粉为材料，采用酸水法提取和乙醇重结晶获得盐酸小檗碱纯品，采用生长速率法研究了盐酸小檗碱对常见植物病原菌的抑制活性。结果表明，盐酸小檗碱的提取率为3.3%，经高效液相色谱法测得其含量为93.56%;抑菌活性试验表明，盐酸小檗碱在100 μg/mL时对玉米大斑病菌的抑制率达99.9%，EC50为8.20 μg/mL，表现出比药剂对照噁霉灵和百菌清更高的抑制活性;进一步的试验表明，与噁霉灵及百菌清相比，盐酸小檗碱对玉米大斑病菌的抑制作用具有持效期长的特点。
　　关键词 盐酸小檗碱; 提取纯化; 含量测定; 抑菌活性
　　中图分类号： S 482.292  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019020
　　Abstract The aim of this study is to measure the antifungal activity of berberine hydrochloride. The root powder of Rhizoma Coptidis was used as material to obtain berberine hydrochloride， the purified product of which was successfully obtained through extraction by using acid-water method and recrystallization with ethanol， and the antifungal activity of berberine hydrochloride against phytopathogenic fungi was investigated using the mycelial growth rate method. The results showed that the extraction rate of berberine hydrochloride was 3.3% and its content was 93.56% measured by HPLC. The results of biological assay indicated that berberine hydrochloride exhibited an excellent antifungal activity against Exserohilum turcicum at the concentration of 100 μg/mL with an inhibition rate of 99.9% and EC50 value of 8.20 μg/mL， which were better than those of hymexazol and chlorothalonil， two commercially available agricultural fungicides. Compared with hymexazol and chlorothalonil， the inhibition effect of berberine hydrochloride on E.turcicum had a longer effective period.
　　Key words berberine hydrochloride; extraction and purification; determination of content; antifungal activity
　　 由真菌和細菌引起的植物病害严重影响作物的产量和品质，是造成巨大经济损失的主要原因之一[1-2]。喷施化学抑菌剂是目前控制病害采取的主要手段，但存在食品安全、环境污染以及易诱导病原物产生抗性等问题。因此，开发新型、安全、环保的农业病害防控技术是当前生产中亟待解决的问题[3]。已有研究证实植物多种次生代谢产物对病害具有良好的抑制作用[4-5]，通过植物获取抑菌成分用于预防和控制农业病害的发生，具有低毒、安全、环境友好等特点，已逐渐成为现代农业中防治病害的一项新型措施[6-7]。
　　小檗碱又称黄连素，一种常见的异喹啉生物碱，主要以盐酸盐的形式广泛分布于植物中，尤其在毛茛科、芸香科、小檗科植物根茎中含量较高，如在黄连中含量最高可达10%，是一种理想的天然药物资源，近年来关于它的生物学及药理学十分广泛[8]。文献报道及临床研究表明，小檗碱具有广谱的抗菌活性，它作为传统中药主要用于菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染疾病[9]，而在抑制病原真菌方面的研究和应用较少，尤其是植物病原菌防治方面。基于此，本研究选用黄连为原料，从中提取分离得到小檗碱，利用液相色谱分析其含量，采用生长速率法测试了其对常见植物病原真菌的抑制活性，探讨盐酸小檗碱对农业病原菌的抑制作用，为基于天然产物的植物源抑菌剂的开发提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　黄连块根：购自宁夏银川国有永吉药店，将块根粉碎成粉末状，过80 目筛，保存备用。
　　供试菌株：玉米大斑病菌Setosphaeria turcica，枸杞根腐病菌Fusarium solani，马铃薯早疫病菌Alternaria solani，马铃薯干腐病菌Fusarium sulphureum，小麦赤霉病菌Fusarium graminearum，苹果腐烂病菌Valsa mali，番茄灰霉病菌Botrytis cinerea，西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum。供试菌株中枸杞根腐病菌和西瓜枯萎病菌为宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室分离并鉴定，其余病菌为西北农林科技大学植物保护学院馈赠。 　　
　　1.2 仪器及试剂
　　仪器：1200型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司;X-4熔点测定仪，巩义市予华仪器有限责任公司;YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司;ZF-2型三用紫外分析仪，上海市安亭电子仪器厂;HPS-250生化培养箱，上海恒科学仪器有限公司。
　　试剂：盐酸小檗碱标准品，上海瑞永生物科技有限公司;噁霉灵及百菌清，纯度≥98%，上海一研生物科技有限公司;薄层层析硅胶，青岛市基亿达硅胶试剂厂;色谱纯甲醇，阿拉丁;色谱纯乙腈，阿拉丁;其他试剂均为分析纯。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 黄连根中小檗碱的提取、分离与纯化及含量测定1.3.1.1 小檗碱的提取、分离与纯化
　　准确称取黄连根粉50 g，加入8倍量的0.5%硫酸水溶液，浸泡24 h，过滤，滤液用石灰乳调pH为10，静置30 min后抽滤，滤液用浓盐酸调pH为 3，再加入滤液量的10%固体氯化钠，搅拌至溶液出现微浊现象为止，放置过夜。抽滤，滤饼用蒸馏水洗3次，50℃烘干得盐酸小檗碱粗品[10]。粗品用热乙醇重结晶即得精制的盐酸小檗碱，使用熔点测定仪测定其熔点，并采用盐酸小檗碱标准品做对照，硅胶薄层层析检测盐酸小檗碱的纯度。
　　1.3.1.2 盐酸小檗碱含量测定[11]
　　色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（35：65）;检测波长345 nm;柱温为室温;流速1 mL/min;进样量为20 μL。
　　标准品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱标准品5 mg于10 mL容量瓶中溶解，超声处理30 min，再取1 mL溶于10 mL甲醇即得标准品溶液，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液备用，即得0.05 mg/mL的标准品溶液，备用。
　　样品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱样品3 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，然后取1 mL转至10 mL容量瓶中，加10 mL甲醇溶解并制成0.03 mg/mL的样品溶液。然后用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
　　1.3.2 抑菌活性测定
　　采用生长速率法[12]測试目标化合物盐酸小檗碱对玉米大斑病菌、枸杞根腐病菌、马铃薯早疫病菌、马铃薯干腐病菌、小麦赤霉病菌、苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌8种病原菌的抑制活性。
　　将盐酸小檗碱用少量丙酮溶解，加入PDA 培养基中，制成含药平板。以加入丙酮溶剂为空白对照组，以噁霉灵和百菌清作为药剂对照。将供试病原菌菌饼（直径0.4 cm）分别接种于含药平板上，于 （28±0.5）℃ 培养箱中培养4～9 d，观察菌丝生长情况，并用游标卡尺采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率，并进行数据处理。
　　抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）对照组菌落直径-0.4×100%。
　　2 结果与分析
　　2.1 小檗碱的提取、分离与纯化
　　2.1.1 盐酸小檗碱的产率与纯度
　　试验用酸水法提取盐酸小檗碱，并采用乙醇重结晶方法纯化，重复3次，提取率为3.3%，试验重现性好。经熔点测定仪测定其熔点为200℃。以盐酸小檗碱标准品为对照，利用硅胶薄层层析法点样，氯仿∶氨∶甲醇=30∶1∶8展开，于三用紫外分析仪下观察，目标化合物盐酸小檗碱与标准品在Rf值为0.62的位置上有相同的绿色荧光斑点，初步判断其为盐酸小檗碱，且纯度较高（图1）。
　　2.1.2 盐酸小檗碱含量测定
　　标准品及样品的HPLC的图谱如图2所示，从图中我们可以看出盐酸小檗碱标准品在1.3.1.2条件下各组分分离良好，在保留时间为3 min时出现目标化合物盐酸小檗碱的色谱峰，峰面积为94.59%。相同条件下，供试样品在3 min时出现对应的色谱峰，峰面积为93.56%，说明从黄连中提取分离纯化的为目标产物盐酸小檗碱，且纯度较高。
　　
　　2.2 盐酸小檗碱的生物活性
　　2.2.1 盐酸小檗碱对常见病原真菌的抑制活性
　　采用菌丝生长速率法测定100 μg/mL盐酸小檗碱及阳性对照100 μg/mL噁霉灵和100 μg/mL百菌清对8种植物病原真菌的抑制作用，结果如表1所示。
　　
　　 由表1可知，在浓度为100 μg/mL时，盐酸小檗碱对马铃薯早疫病菌、番茄灰霉病菌、枸杞根腐病菌、苹果腐烂病菌、马铃薯干腐病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌均都表现出较低的抑制活性，抑制率为7.2%～44.0%，但对玉米大斑病菌的抑制率为99.9%，表现出比阳性对照噁霉灵（82.8%）和百菌清（48.0%）更高的抑制活性。在所有供试病菌中，盐酸小檗碱只表现出对玉米大斑病菌高的抑制活性，这表明盐酸小檗碱在农作物病原菌抑制方面有可能是一种较专一性的抑菌剂，但本试验的供试菌种数量有限，对其他病原菌的作用有待进一步研究。
　　2.2.2 盐酸小檗碱对玉米大斑病菌抑制活性的持效性
　　在2.2.1的基础上，继续观察并记录盐酸小檗碱及阳性对照噁霉灵和百菌清对玉米大斑病菌的抑制情况，每隔24 h观察记录1次，持续到第9天，其抑菌率如表2所示、抑菌效果如图3所示。结果显示，第4天和第9天，盐酸小檗碱对玉米大斑病菌的抑制率都均为99.9%，而噁霉灵的抑制率从82.8%下降为56.1%，百菌清的抑制率从48.0%下降为27.1%，由此可知，与噁霉灵及百菌清相比，盐酸小檗碱对玉米大斑病菌的抑制作用随着时间的延长，抑制效果可维持不变，在离体培养下具有持效期长的特点。
　　2.2.3 化合物对玉米大斑病菌的EC50测定
　　按照1.3.2抑菌活性测试方法，测定了化合物盐酸小檗碱、噁霉灵和百菌清梯度浓度下对玉米大斑病菌的抑制活性，并根据抑菌结果计算EC50，结果如表3所示。 　　
　　 化合物盐酸小檗碱表现出对玉米大斑病菌较高的抑制活性，抑制率为99.9%（表1），以噁霉灵和百菌清原药为阳性对照，进一步研究了盐酸小檗碱在梯度浓度下对玉米大斑病菌的抑制效果，以浓度的对数作为x轴，以抑制率的几率值作为y轴，利用软件SPSS 22.0求取毒力回归方程并计算半数效应浓度EC50，结果如表3所示。由表中可以看出，盐酸小檗碱对玉米大斑病菌的EC50为8.20 μg/mL，远低于噁霉灵和百菌清对该菌的EC50值（噁霉灵和百菌清对玉米大斑病菌的EC50分别为11.92 μg/mL和13.52 μg/mL），表现出较好的抑制活性。
　　3 结论
　　以黄连根粉为原料提取纯化获得盐酸小檗碱纯品，提取率为3.3%;以盐酸小檗碱标准品为对照，利用高效液相色谱法测定其含量为93.56%;采用菌丝生长速率法对盐酸小檗碱的抑菌活性进行了研究，结果表明，在所有供试病菌中，盐酸小檗碱在100 μg/mL时表现出较专一的对玉米大斑病菌高的抑制活性，抑制率为99.9%，EC50为8.20 μg/mL，抑制活性高于阳性对照噁霉灵和百菌清;化合物对玉米大斑病菌持续抑制情况观察表明，与噁霉灵及百菌清相比，盐酸小檗碱对玉米大斑病菌的抑制作用具有持效期长的特点。盐酸小檗碱作为一种在植物中含量较高的天然药物资源，在抑菌方面表现出的这种专一性和较高的抑制活性，有待于我们进一步研究，为开发高效、低毒新型农用杀菌剂提供理论参考。
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　　（责任编辑： 田 喆）
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