灰色链霉菌LD1810产胰蛋白酶发酵条件的优化

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　　摘要胰蛋白酶（Trypsin）作用于碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键，被广泛用于食品、医药和皮革等工业领域。该文研究高产诱变灰色链霉菌LD1810产胰蛋白酶（SGT）的最优发酵培养基，探讨SGT的最佳发酵条件，为SGT的商业化生产提供技术参考。通过单因素试验和L9（34）正交试验确定发酵培养基的最佳组分：葡萄糖 20 g/L，大豆粉 40 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 1 g/L。最适发酵条件为发酵温度28 ℃，初始pH 8.0，300 mL 三角瓶的装液量100 mL，摇床转速 240 r/min。
　　关键词灰色链霉菌;胰蛋白酶;培养基;发酵条件
　　中图分类号S-3文献标识码A文章编号0517-6611（2019）02-0007-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.003
　　胰蛋白酶（Trypsin，EC 3.4.4.4）是蛋白水解酶类的一种[1]，具备由天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸氨基酸残基所组成的催化三联体的典型特征。胰蛋白酶具有的2个重要特征可以将其与其他丝氨酸蛋白酶区分开来：能专一性地把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用[2]。另外，在碱性条件下胰蛋白酶具有较高的催化活力，所以是一种碱性蛋白酶。胰蛋白酶在医药[3-6]、食品[7]、皮革加工[8]、纺织和农业领域[9]有着广泛的应用价值。
　　通过链霉菌属菌株产的胰蛋白酶主要有红热链球菌Streptomyces eryrhreus产胰蛋白酶（SET），弗氏链霉菌Strepromyces fradiae产胰蛋白酶（SFT）和灰色链霉菌Streptomyces  griseus产胰蛋白酶（SGT）。目前，微生物产胰蛋白酶仍处于研究阶段，产酶效率不高，与商業化生产仍有差距。该研究探讨高产胰蛋白酶的诱变灰色链霉菌菌株的最优发酵培养基，同时探寻SGT的最佳发酵条件，为SGT的商业化生产提供依据。
　　1材料与方法
　　1.1菌株
　　灰色链霉菌为山东隆科特酶制剂有限公司省重点实验室诱变筛选保藏菌种（Streptomyces griseus），命名为LD 1810。
　　1.2培养基斜面培养基：PDA培养基;
　　基础发酵培养基：豆饼粉40 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸镁2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L。
　　1.3培养基组成的确定
　　保持基础培养基其他组成不变，依次改变培养基的氮源、碳源和无机盐，测定发酵液中胰蛋白酶活力。确定最佳氮源、碳源和无机盐后，对氮源、碳源及无机盐进行正交设计试验，以找出菌体发酵最好的优化培养基，试验因素及水平见表1。
　　1.4产酶培养条件的确定
　　试验分别从培养温度、培养基初始 pH、摇瓶培养基装液量和摇床转速等方面进行单因素试验，确定最佳培养条件。
　　1.4.1培养温度对发酵产酶的影响。
　　分别设定发酵温度为24、26、28 、30和 32 ℃，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，pH 8.0，装液量100 mL，240 r/min条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同温度条件下发酵产酶的变化规律。
　　1.4.2初始pH对发酵产酶影响的研究。
　　分别取初始pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，28 ℃，装液量100 mL，240 r/min条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同pH条件下发酵产酶的变化规律。
　　1.4.3装液量对发酵产酶影响的研究。
　　装液量分别选取50、75、100、125、150和200 mL，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，28 ℃，pH 8.0，240 r/min条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同装液量条件下发酵产酶的变化规律。
　　1.4.4转速对发酵产酶的影响。
　　分别取转速为100、150、200、240、260和300 r/min，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，28 ℃，pH 8.0，装液量100 mL条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同转速条件下发酵产酶的变化规律。
　　1.5酶活测定方法
　　胰蛋白酶参照中国药典方法[10]进行测定。
　　2结果与分析
　　2.1发酵时间的确定
　　灰色链霉菌在摇瓶中培养7 d，每24 h 取样测酶活。由图1可知，灰色链霉菌发酵前5 d，胰蛋白酶酶活性迅速上升，酶活力持续增加，发酵5 d时酶活力最高达到81.5 U/mL。发酵5 d后，随着发酵时间的延长，酶活有所下降，究其原因是发酵后期，营养物质消耗殆尽，微生物衰老死亡，产酶能力下降。综合发酵的变化情况，选取5 d作为发酵时间。
　　2.2灰色链霉菌产酶发酵培养基的确定
　　2.2.1碳源种类对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。
　　基础培养基中分别添加浓度为2%的不同碳源作为唯一碳源，发酵产酶结果见图2，结果表明，葡萄糖作为碳源时灰色链霉菌所产酶活最大，为85.4 U/mL，麦芽糖次之，菌种对这2种碳源利用效果较好，说明菌体对麦芽糖和葡萄糖的利用最好。葡萄糖不仅能够提供合成代谢所需的能量，也能在细胞分解代谢中提供小分子碳架，同时葡萄糖较为廉价，因而选择葡萄糖作为碳源。
　　2.2.2氮源种类对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。 　　氮源是作为构成生物体的氨基酸、核酸及其他氮素化合物的材料，也能作为细胞壁的组成成分。分别添加浓度为4%的不同碳源作为唯一氮源，对胰蛋白酶活力的影响见图3，结果表明，在相同培养时间，选取的几种氮源，对产酶能力的影响有所不同。酵母粉作为氮源时，灰色链霉菌产酶活力最佳为83.5 U/mL;另外，选用大豆粉作氮源时，菌株产酶能力只是略低于酵母粉为82.4 U/mL。考虑到实际的生产情况及经济效益，选择大豆粉作为氮源更能节约成本，并且达到良好的发酵产酶效果。
　　2.2.3无机盐种类对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。
　　无机盐不仅是微生物生长不可或缺的营养成分和组成成分，还可以构成酶的活性基团或作为酶的激活剂;另外无机盐可以调节细胞的渗透压、酸碱度、氧化还原电位等。该试验培养基中分别添加浓度为0.2%的不同无机盐，以不添加无机盐为对照，无机盐对胰蛋白酶活力的影响见图4，结果表明，KH2PO4、CaCl2和MgSO4可显著提高酶活力。通过相关文献[11-12] 可以得知，KH2PO4可以作为缓冲剂，能够稳定培养基的pH，保持微生物生长所需的酸碱度。钙离子在酶合成过程中起到诱导剂和稳定剂作用，镁离子是生物代谢途径中多种酶的促进剂。因此，优化培养基中的无机盐应有KH2PO4、CaCl2和MgSO4。该试验在优化培养基中选择影响更为明显的KH2PO4和CaCl2作为试验因素。
　　2.2.4灰色链霉菌产胰蛋白酶最佳发酵培养基优化。
　　在单因素试验基础上，选取对灰色链霉菌产胰蛋白酶活力影响显著的葡萄糖、大豆粉、KH2PO4和CaCl2作为考察对象，选用L9（34）正交试验进行分析。由表2可以看出，正交试验设计的4个因素对菌体发酵无特别明显影响，由极差分析结果可知，R2>R1>R3>R4，试验中4个因素的相对影响顺序为B>A>C>D即大豆粉>葡萄糖>KH2PO4 >CaCl2。菌体发酵产酶最高组合的无机盐组合为葡萄糖 20 g/L，大豆粉 40 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 1g/L。在此条件下，测得胰蛋白酶活力为88.4 U/mL。因此，选取菌体发酵产酶的最高组合为A2B3C2D3。
　　2.3灰色链霉菌产酶发酵条件的确定
　　2.3.1培养温度对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。
　　发酵温度分别在24、26、28、30、32和 34 ℃下培养5 d，测定发酵液蛋白酶活力，结果如图5所示，结果表明，在28 ℃下培养菌体产生的胰蛋白酶活力较高，此时菌株酶活达87.4 U/mL;温度为24～28 ℃时，随着温度升高有利于生长代谢和胰蛋白酶的产生，酶活逐渐增加;温度为28～34 ℃时，随温度继续升高导致酶失活速度加快，同时影响菌体正常的生长和代谢，进一步促进细菌衰老死亡，導致产酶量的降低。因此，选择28 ℃作为培养温度。
　　2.3.2初始pH对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。
　　调节培养基初始 pH 分别为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，在不同pH下培养5 d后，测定发酵液的胰蛋白酶活力，结果如图6所示，结果表明，初始 pH 7.5～8.5，产酶效果较好;pH为8.0时，菌种酶活最高为86.3 U/mL。pH继续增大，酶活力逐渐减低，说明弱碱性培养基下有利于菌株产酶。pH通过影响菌体营养物质离子化程度、细胞膜电荷及膜渗透性，从而影响菌体对养分的吸收。该试验选择pH 8.0作为初始pH。
　　2.3.3装液量对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。
　　在 300 mL 三角瓶中分别装入50、75、100、125、150和200 mL的培养基，培养5 d后测定发酵液蛋白酶活力，结果如图7所示。结果表明，装液量为50～100 mL时，随着装液量的增加，蛋白酶活力随之增加;当装液量为100 mL时，胰蛋白酶活力相对最高;但随着装液量继续增大，胰蛋白酶活力反而降低。 装液量过大时三角瓶中溶解的氧浓度小，影响氧气的传递，不利于菌体获得营养，从而导致菌体不能正常生长代谢，影响菌株产酶[13]。因此，选择100 mL作为该试验的装液量。
　　2.3.4摇床转速对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。
　　分别在100、150、200、240、260和300 r/min摇床转速下进行培养5 d，测定发酵液胰蛋白酶活力，结果如图8所示，揺床转数为240 r/min 时，菌株产胰蛋白酶的酶活力相对较高。菌体在液体培养下需要大量氧气来满足菌体生长和产酶需要，转速过低，通气量小，发酵液溶氧不够，不利于菌体生长繁殖及酶的合成;转速过快，可能导致菌体自溶，酶活力降低。该试验选择240 r/min作为摇床转速。
　　3结论
　　对灰色链霉菌产胰蛋白酶的培养基及培养条件进行优化。对碳源种类、氮源种类和无机盐种类进行单因素试验，利用单因素试验结果，进一步进行正交试验，最终确定灰色链霉菌产胰蛋白酶的最优培养基为葡萄糖 20 g/L、大豆粉 40 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、CaCl2 1 g/L。在培养温度为 28 ℃，初始 pH为 8，300 mL 三角瓶的装液量为 100 mL 及转速为
　　240 r/min的条件下培养5 d，有利于灰色链霉菌菌株LD1810产胰蛋白酶，所产胰蛋白酶的酶活力可达到 88.4 U/mL 左右。
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