周楸腋芽离体培养快繁技术研究

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　　摘要：为研究周楸组织培养快繁技术，以周楸2号为材料，对带腋芽茎段离体培养不同阶段培养基中萘乙酸（NAA）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）浓度分别设计4个水平，通过研究NAA和6-BA主效应及交互作用对腋芽诱导率、无菌苗增殖系数和NAA对无菌苗生根率的影响，以期明确周楸腋芽离体培养时最适激素条件。研究表明，周楸2号带腋芽茎段离体培养诱导培养基适宜的激素水平为NAA 0.010～0.015 mg/L，6-BA 0.6～1.2 mg/L;增殖培养基适宜的激素水平为NAA 0.15～0.20 mg/L，6-BA 0.8～1.6 mg/L;生根培养基适宜的激素水平为NAA 1.0～1.5 mg/L。
　　关键词：周楸2号;腋芽;离体培养;NAA;6-BA;组织培养
　　中图分类号： S723.1+32.6  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0065-05
　　楸树（Catalpa bungei C. A. Mey.）为紫葳科落叶乔木[1]，其材质优良、生长快、寿命长、适应能力强，是常用的植树造林树木之一;同时楸树枝叶繁茂、花开锦簇，景观效果独具特色，因此楸树亦被广泛应用于沿路、沿河、沿水和园林绿化。随着社会环保意识的增强和环境保护措施的不断落实，在大规模乡村和城市绿化中，政府大力倡导以选用优良本土树种为主，楸树为河南省周口市城乡绿化首选天然分布树种之一，目前，楸树产业迎来巨大发展空间和机遇。
　　近年来，楸树组织培养技术研究得了人们的重视，楸樹组织培养（组培）育苗克服了传统育苗生产中存在的常见问题（种子量少[2]、育苗周期长、苗木生长性状一致性差、苗木数量和质量难以满足生产要求、嫁接苗由于插穗和砧木对水分需求不一致易导致“小脚”病、埋根影响母树生长[3]、扦插生根率低[4]等）。近年来有关楸树组织培养（组培）育苗的报道较多，范国强等对金丝楸幼嫩茎段进行离体培养，初次探讨金丝楸组培不同阶段适合的培养基和激素组合[5]。李艳敏等以金丝楸为试材，采用改变继代培养方式、将增殖和壮苗培养相结合、添加对活性炭等措施，使金丝楸组培工厂化生产顺利进行[6]。王爱芝对花楸的幼胚等5种不同外植体进行研究，指出适合花楸茎段和片叶的诱导与增殖培养条件[7]。韩创举对豫楸一号扦插、嫁接、组织培养等无性繁殖技术参数进行研究，指出芽接是常规苗木生产中简单易行的育苗方法，并且对楸树组织培养条件进行探讨[8]。王改萍等对圆基长果楸、豫楸1号、豫楸2号、梓树4个品种试验材料的研究表明，初代培养基最适激素水平为N6+6-苄基腺嘌呤（6-BA） 1.5 mg/L+萘乙酸（NAA） 0.01 mg/L[9]。杨燕等通过对圆基长果楸和灰楸的5种不同外植体，采用11种不同灭菌处理方法，5种不同培养基及不同生长素、细胞分裂素、琼脂浓度和蔗糖组合进行试验研究，为楸树组培育苗进一步研究提供了完整的技术参考[10-11]。刘小云对圆基长果楸组织培养各项技术进行了全面研究[12]。翟晓巧等对灰楸茎段诱导成苗进行研究[13]。姜何对新品种鲁楸1号的组培育苗进行综合研究，分别建立了圆基长果楸、灰楸、鲁楸1号的最适培养体系[14]。张烨然等以楸树（QS2）和滇楸（DQ72）的优良单株为试材，对其茎段进行初代与增殖培养，提出QS2和DQ72适宜的初代培养基激素水平为DKW+6-BA 1.0 mg/L+吲哚丁酸（IBA） 0.1 mg/L，增殖培养阶段适宜激素水平为DKW+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L[15]。而关于周楸系列的组培研究尚未见报道。周楸2号原产于河南省周口市，具有喜光、深根、速生等特点，其生长特性表现优良，在园林绿化、固沙保土、家具用材及用药等领域被广泛应用，有较大的发展前景，目前市场对其苗木需求大，优质苗木供需矛盾突出。本试验对周楸2号进行离体培养快繁技术研究，以期探讨出周楸组培快繁不同阶段适合的激素组合，为楸树产业化育苗技术研究提供支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　供试材料为周楸2号，引自河南花博士花卉有限公司楸树种植基地。
　　1.2 试验方法
　　供试基本培养基为N6，蔗糖、琼脂用量参考杨燕的研究结果[10]，光照及温度条件参考王改平等的研究结果[9，16]。诱导、增殖和生根培养每培养瓶中接种3个芽点，每个处理接种5瓶，重复5次，随机区组排列。
　　1.2.1 试验材料获取与消毒 于2019年3月21日上午采集周楸2号当年生长充实的枝条，并将采集枝条带回实验室，剪成长15 cm带腋芽枝段，采用1/2 Hogland's营养液进行培养，培养过程中24 h更换1次培养液，共培养10 d[8]。将顶芽和腋芽新萌发芽点切割成2 cm长茎段，带腋芽茎段的消毒灭菌依据杨燕的研究[10]。
　　1.2.2 楸树无菌苗获取 在N6培养基上，NAA浓度设A1（0.005 mg/L）、A2（0.010 mg/L）、A3（0.015 mg/L）、 A4（0.020 mg/L）4个水平;6-BA浓度设B1（0.6 mg/L）、B2（0.9 mg/L）、B3（1.2 mg/L）、B4（1.5 mg/L）4个水平。将消毒后带芽点茎段，分别接种至上述16组不同处理的诱导培养基中，培养35 d后，统计发芽腋芽茎段数量，计算诱导率[10]。
　　1.2.3 楸树无菌苗继代培养 在N6培养基上，NAA浓度设C1（0.05 mg/L）、C2（0.10 mg/L）、C3（0.15 mg/L）、C4（0.20 mg/L）4个水平;6-BA浓度设D1（0.8 mg/L）、D2（1.2 mg/L）、D3（1.6 mg/L）、D4（2.0 mg/L）4个水平。选取无污染、生长健康、经过35 d培养的楸树无菌苗进行增殖培养，将无菌楸树苗切成长1.5 cm的带腋芽茎段，分别接种至上述16组不同处理的增殖培养基中，培养35 d后，统计再生芽个数，计算增殖系数[10]。 　　1.2.4 楸树组培苗生根培养 在N6培养基上，NAA浓度设0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 4个水平，然后选取经过增殖培养的无菌苗，分别接种至上述不同NAA水平的生根培养基中培养30 d后，统计生根无菌苗数量，计算生根率[10]。
　　1.3 数据分析
　　试验数据用SPSS 22.0进行统计分析，双因素方差分析以及用LSD法进行多重比较。
　　2 结果与分析
　　2.1 诱导培养基不同激素浓度对诱导率的影响
　　从表1可以看出，NAA和6-BA 2因素交互对周楸20号诱导率作用显著（P=0.004<0.05）。从表2可以看出，诱导培养基NAA浓度为0.015 mg/L时，0.9 mg/L 6-BA与0.6、1.2、1.5 mg/L等其他3个浓度水平相比，差异均达显著水平;A3B2处理对腋芽诱导率的影响优于其他浓度激素组成。
　　从表1可以看出，对楸树腋芽诱导率的影响 6-BA显著（P=0.000<0.05），而NAA不显著（P=0.303>0.05）。从表3可以看出，楸树腋芽诱导率的影响因素以6-BA为主，其次为NAA。不同浓度NAA处理下，A3水平NAA对应的楸树腋芽诱导率平均数最大，对楸树腋芽诱导率影响最大，不同浓度NAA对楸树腋芽诱导率影响顺序依次为A3>A2>A4>A1;同理可以得出，不同浓度6-BA对楸树腋芽诱导率影响顺序依次为B2>B3>B1>B4;即处理A3B2对腋芽诱导率的影响优于其他试验设计方案，与简单分析结果一致。从表4可以看出， 在NAA和6-BA交互作用影响下， 处理A3B2對楸树腋芽诱导率影响最大，其他设计方案中较优组合有A4B3、A2B1。
　　2.2 增殖培养基不同激素浓度对增殖系数的影响
　　从表5可以看出，NAA和6-BA 2因素交互对周楸20号增殖系数的作用不显著（P=0.358>0.05）;NAA和6-BA对楸树无菌苗增殖系数的影响显著（P=0.005<0.05、P=0.001<0.05），其中 6-BA 为主要影响因素，NAA次之。从表6可以看出，当激素浓度组成为C3D1和C4D2时，腋芽增殖系数优于其他激素浓度组成。
　　从表7可以看出，不同浓度NAA对楸树无菌苗再生的影响顺序依次为C4>C3>C2>C1，C4对应的增殖系数平均数最大;不同浓度6-BA对楸树无菌苗增殖系数影响顺序依次为D2>D3>D1>D4。在NAA和6-BA的交互作用影响下，从表8可以看出，试验设计方案C3D1和C4D2对楸树腋芽增殖系数影响最大，而其他设计方案中较优组合有C3D2、C4D3。
　　2.3 生根培养基中不同NAA浓度对生根率的影响
　　从表9可以看出，1.0、1.5 mg/L NAA与0.5、2.0 mg/L相比，生根率分别提高71.42%、57.12%，差异达显著水平。
　　3 讨论与结论
　　在植物组织培养育苗技术研究中，植物生长调节剂是影响植物离体形态发生的最关键因素[17]。目前关于楸树组织培养的培养基中不同激素组合对不同外植体诱导分化、增殖和生根影响的研究报道较多，试验所采用楸树品种、外植体、取材时间等不同，最适基本培养基类型、植物生长调节剂种类及浓度等条件不同[5-15，18-23]。本试验初次通过分析NAA和 6-BA主效应及其交互作用对周楸带腋芽茎段诱导率、无菌苗增殖系数的影响，以及NAA不同浓度与生根率的关系，研究周楸腋芽离体培养不同阶段的最适NAA和6-BA水平。
　　本试验分析诱导培养基中不同浓度水平NAA和6-BA对楸树腋芽诱导率的影响，结果发现，6-BA 主效应和NAA与6-BA之间交互作用显著;对试验数据进行分析认为，诱导培养基中NAA和6-BA最优组合为A3B2;在NAA 4个浓度水平中，A3处理周楸2号腋芽诱导率平均值最大;而在不同 6-BA 浓度中B2处理周楸2号腋芽诱导率平均值最大，诱导培养基中最优处理组合为A3B2。最优处理组合A3B2的周楸2号腋芽诱导率平均数为23.333%;其次为A4B3、A2B1，这2个处理周楸2号腋芽诱导率平均数分别为21.113%、19.443%;再其次为A1B2、A2B3、A3B1、A2B2、A4B1、A4B2，周楸2号腋芽诱导率平均数分别为16.113%、16.113%、15.003%、15.000%、14.447%、14.447%;处理组合中周楸2号腋芽诱导率平均数较高的前3个组合为A3B2、A4B3、A2B1，培养基中NAA浓度与6-BA浓度的比值均为0.017，而处理组合A1B2、A2B3、A3B1、A2B2、A4B1、A4B2中培养基中NAA浓度与6-BA浓度的比值均分别为0.006、0.008、0.025、0.011、0.033、0.022。因此可以认为，诱导率不仅与培养基中NAA和6-BA的浓度有关，与NAA浓度/6-BA浓度也有一定关系，且6-BA对诱导率的影响较大，因此依据综合分析初步认为，诱导培养基合适的激素水平是NAA浓度范围为0.010～0.015 mg/L;6-BA浓度范围为 0.6～1.2 mg/L。而NAA和6-BA 2因素主效应和交互作用对诱导率的影响机制有待进一步研究阐明。
　　增殖培养基中NAA和6-BA对无菌苗再生的主效应显著，其交互作用对楸树增殖系数的影响不显著;在NAA 4个浓度水平中，C3处理楸树无菌苗增殖系数最高;在6-BA 4个浓度水平中，D2处理楸树无菌苗增殖系数最高，因此可以认为，增殖培养基在NAA和6-BA主效应影响下，最优处理组合为C3D2。但在NAA和6-BA交互作用下，C3D1、C4D2处理楸树腋芽增殖系数平均数最大，为4.8，为最优处理组合;其次为C3D2、C4D3处理组合，楸树腋芽增殖系数平均数为4.4;C3D1和C4D2处理组合中NAA与6-BA的浓度比值分别为0.188和0.167，C3D2和C4D3处理组合中NAA与6-BA的浓度比值均为0.125，初步认为增殖培养基合适的激素水平是NAA浓度范围为0.15～0.20 mg/L;6-BA浓度范围为0.8～1.6 mg/L。培养基中NAA和6-BA的浓度及其比值不仅影响楸树茎段腋芽诱导，对无菌苗再生增殖也存在一定影响，NAA和6-BA 2因素主效应和交互作用对楸树茎段无菌苗增殖系数的影响机制有待进一步研究阐明。 　　生根培养基中，NAA浓度为1.0 mg/L和 1.5 mg/L 时，培养3 d后有根源基凸起，培养30 d后须根长5 cm，NAA浓度为 1.0 mg/L 时须根生长快，且须根较多;当NAA浓度为2.0 mg/L时，生根率反而下降，表明高浓度NAA不利于根源基形成和幼根生长。
　　周楸2号带腋芽茎段离体培养不同阶段，对NAA和6-BA的浓度及其比值需求不同。在诱导培养阶段，需要较低浓度的NAA和较高浓度的6-BA，NAA与6-BA的浓度比值为0.017时诱导率较高，这可能与腋芽本身所含NAA水平较高有关;在增殖培养阶段，需要较高浓度的NAA和6-BA，NAA与6-BA的浓度比值为0.167左右时增殖系数较高;生根培养基阶段根源基的诱导需要一定浓度的NAA，但过高浓度NAA会抑制幼根生长。
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