1702例妇女宫颈人乳头瘤病毒的检测与基因分型

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　　[摘要] 目的 对祥云县1 702例妇女宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染情况、亚型分布以及不同型别病理情况进行详细的探讨，为本地区预防和治疗宫颈癌提供理论依据。 方法 方便收集1 702例2014年12月—2015年11月在該院就诊并自愿接受宫颈HPV检查的妇女宫颈脱落细胞标本，采用PCR-反向斑点杂交技术分析HPV-DNA亚型、感染率及年龄分布，同时结合病理活检结果分析不同型别的病理发展改变。结果HPV-DNA分型检测阳性率为7.52%，最常见的HPV感染频率为HPV-16、HPV-52、HPV-51、HPV-58、HPV-18、HPV-43、HPV-33、HPV-42；年龄标化HPV感染率与年龄标化HR-HPV变化一致，18～37各年龄组间有明显差异（P<0.05）；38～57岁无明显差异；58岁以上各年龄组间又有明显差异（P<0.05）。各年龄组LR-HPV感染率方面，18～32年龄组差异有统计学意义（P<0.05），33岁以后各组间差异无统计学意义（P>0.05），在HPV多重基因亚型混合感染方面，18～组最高，其次为22～、27～、57～、62～组，其他最低，各水平之间均差异有统计学意义（P<0.05）。 结论HPV分型检测对妇女宫颈病变的筛查具有非常重要的意义，并且高危型HPV感染与宫颈病变的严重程度相关，其能够为临床诊断和治疗提供科学的理论依据。
　　[关键词] 人乳头瘤病毒；检测；基因分型
　　[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）03（c）-0180-03
　　[Abstract] Objective To investigate the infection of human papillomavirus （HPV） in cervix of 1 702 women in Xiangyun County， and to provide theoretical basis for the prevention and treatment of cervical cancer. Methods 1 702 cases of cervical exfoliated cells were collected from December 2014 to November 2015. The HPV-DNA subtype， infection rate and age distribution were analyzed by PCR-reverse dot blot hybridization. The pathological changes of different types were analyzed by pathological biopsy. Results The positive rate of HPV-DNA typing was 7.52%. The most common HPV infection frequencies were HPV-16， HPV-52， HPV-51， HPV-58， HPV-18， HPV-43， HPV-33 and HPV-42. The age-standardized HPV infection rate was consistent with that of age-standardized HR-HPV， and there was no statistically significant difference between 18～37 age groups （P<0.05）. There was also statistically significant difference among all age groups （P<0.05）. The LR-HPV infection rate of 18-32 age group was statistically significant different from that of 33 age group （P<0.05）. There was no statistically significant difference among the groups after 33 years old （P>0.05）. In the mixed infection of multiple genotypes of HPV， 18～group was the highest， followed by 22～27～57～62～group， the other was the lowest （P<0.05）. Conclusion HPV typing detection is very important for screening cervical lesions in women， and high-risk HPV infection is related to the severity of cervical lesions， which can provide scientific theoretical basis for clinical diagnosis and treatment.
　　[Key words] Human papillomavirus； Detection； Genotyping
　　宫颈癌是妇科常见的一种恶性肿瘤，有数据显示，其发病率在逐年升高，目前仅次于乳腺癌。因此，及早发现HPV是提高宫颈癌防治效果的前提[1]。随着HPV检测方案在临床上的推广，大量单纯HPV阳性但是细胞学阴性的问题出现了，不但体现出了细胞学检查的局限性，进一步提示对患者进行HPV检查的必要性[2]。目前，临床上对宫颈癌检测与分型的主要辅助方法就是HPV-DNA分型检测，其能够有效防止恶性宫颈病变的漏诊，对HPV的型别进行区分，为临床制定干预措施提供科学的依据。该文2014年12月—2015年1月间对1 702例妇女进行HPV基因分型检测，进一步探讨了HPV基因分型检测在宫颈病变筛查中的价值。报道如下。 　　1 对象与方法
　　1.1 研究对象
　　方便收集1 702例在该院就诊并自愿接受宫颈HPV检查的妇女宫颈脱落细胞标本，该组中年龄18～70岁，平均年龄（48.5±4.3）岁。纳入标准为：未行子宫切除术；就诊前24 h无性生活，72 h无阴道用药史；就诊时为无月经期和非妊娠状态。
　　1.2 标本采集
　　用消毒灭菌的扩阴器打开宫颈口并用洁净棉拭子擦净分泌物，再将专用宫颈刷深入宫颈口2～3 cm处顺时针旋转4～5圈，获取宫颈脱落细胞。将标本放入装有细胞保存液的试管中拧紧瓶盖置于4℃保存，且在1周内完成检测。
　　1.3 标本处理
　　将标本管中样本液摇匀取200 uL装入1.5 mL的离心管中，将离心仪的转速调整为10 000 rpm离心5分钟，分离出上层清液，留沉淀（若样本有其他杂质如溶血或漂浮物，可以使用蒸馏水洗涤1～2次）。将阳性和阴性质控品解冻混匀，各取10 uL，分别加入1.5 mL的离心管。样本沉淀及质控品，分别加50 uL的DNA提取液混匀，煮沸10 min，将离心仪的转速调整为10 000 rpm离心5 min，取上层清液备用。
　　1.4 PCR扩增
　　取HPV23PCR反应管，解冻离心后（另换手套），分别加入样本提取液或质控品提取液上清5 uL。PCR反应管液6 000 rpm瞬时离心，放入PCR仪，按下列程序条件扩增：50℃ 3 min、93℃5 min、93℃40 s、55℃40 s、72℃40 s×40个循环、72℃7 min、95℃5 min、4℃5 min。
　　1.5 杂交反应
　　杂交：取15 mL离心管，放入标记膜条1张，加5～8 mL预热A液、对应的40 uL PCR产物，盖紧管盖，放入振荡槽46℃轻摇（100～150 r/min）60 mm。弃去液体。偶联：取50 mL离心管，加预热B液20 mL，C液1 mL，混匀，放入杂交膜条（每次可同时处理5张膜条，若5～10张则B液和C液分别为40 mL和2 mL），46℃轻摇（40～50 r/min）10 min，弃去液体。加预热B液40 mL，46℃轻摇3 min，弃去液体；重复1次；加D液40 mL，46℃轻摇3 min，弃去液体。
　　该次操作由该院妇科工作经验丰富，工作年限在5年以上的人员完成，该次进行PCR-反向斑点杂交技术，先用PCR法检测样本中是否有可倍增的HPV DNA，然后对HPV亚型进行检测。
　　1.6 统计方法
　　采用SPSS 19.0统计学软件对该次研究所得到的数据进行处理，计数资料用百分比（%）表示，进行χ2 检验，P< 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 HPV检测结果
　　该研究1 702例受试者宫颈脱落细胞标本中，共检出HPV感染阳性者共128例，感染率为7.52%。见表1。
　　2.2 HPV在感染者中的年龄分布
　　该组1 702例妇女中，其年龄段为18～70岁，平均（48.5±4.3）岁，将其分为11个年龄段。在HPV多重基因亚型混合感染方面，18～组最高，其次为22～、27～、57～、62～组，其他最低，各水平之间均差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
　　2.3 HPV的基因型分布
　　HPV-DNA分型检测阳性率为7.52%，最常见的HPV感染频率为HPV-16、HPV-52、HPV-51、HPV-58、HPV-18、HPV-43、HPV-33、HPV-42；HR-HPV感染率为6.41%，LR-HPV的感染率为14.67%，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2.4 HPV不同基因型的病理改变
　　该组中检出癌前病变患者19例，宫颈癌患者4例，无癌前病变2例。见表3。
　　3 讨论
　　3.1 HPV亚型分布特点
　　宫颈癌对女性的身体健康造成了严重的威胁，大量的研究结果发现，HPV的持续感染是导致宫颈癌的主要病因[3]。临床上将能够导致宫颈癌以及癌前病变的HPV称为HR-HPV，将与生殖道等良性病变相关的HPV称之为LR-HPV。该次研究结果显示，HPV-16是导致宫颈癌的主要因素，而HPV-43和HPV-42是导致生殖器良性病变的主要因素[4]。
　　经流行病学调查研究显示[5]，不同的HPV型别的感染也会存在明显的地域性差别。在祥云县HR-HPV前3位亚型分别为HPV-16、HPV-52、HPV-58，其在高危型感染人群中的构成比共占69.05%，而LR-HPV前两位亚型分别为HPV-43、HPV-42，其在感染人群中的构成比占90.91%[6]。该次研究结果还显示，HPV总感染率为19.26%，HR-HPV感染率为6.41%，LR-HPV的感染率为14.67%，这与张晓艳[7]等人所研究出来的19.17%、6.39%和15.01基本一致。其中感染率的不同可能与检测方法、地域、人群等差异有关。
　　3.2 HPV亚型年龄分布的特点
　　年龄与HPV感染密切相关，有研究显示，HPV在年轻妇女人群中的感染率最高，且随着年龄的增长HPV的感染率会逐渐降低。该次研究结果显示， HR-HPV感染在<30岁妇女中最高，33～52比较稳定，且最能代表人群感染的水平。53岁以后有所上升，但是与感染前相比较，还比较低。<30岁的女性感染LR-HPV的几率比较高，33岁以后则趋于稳定。在HPV多重基因亚型混合感染方面，18～组最高，其次为22～、27～、57～、62～组，其他最低，各水平之间均存在显著差异（P<0.05）。
　　吕虹等人[8]在研究中发现，HPV 的感染率在35岁以下女性人群中最高，并且其随着女性年龄的增长而降低。这可能是由于中年女性在绝经后其体内的雌激素水平会发生明显的变化，免疫力降低，导致HPV感染高发
　　3.3 HPV混合感染
　　临床上HPV多重基因亚型混合感染的情况比较少见，并且这与所研究的人群、地域以及检测方法等也有着密切的关系。该次研究中，1 702例女性中15例（3.91%）出现了混合感染，这也为疫苗的研制和应用提出了更高的要求。
　　综上所述，HPV分型检测对妇女宫颈病变的筛查具有非常重要的意义，并且高危型HPV感染与宫颈病变的严重程度相关，其能够为临床诊断和治疗提供科学的理论依据。
　　[参考文献]
　　[1] 金龙妹，张晓华，肖丽萍，等.116441例普查妇女宫颈人乳头瘤病毒基因分型情况分析[J].蚌埠医学院学报，2018，43（4）：462-467.
　　[2] 张丽敏，方芳，陈柯霖，等.妊娠及体检妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因分型检测特征分析[J].中国实验诊断学，2018， 22（2）：265-268.
　　[3] 董琴.辖区已婚妇女宫颈人乳头瘤病毒感染状况和基因分型[J].临床医学，2016，36（7）：79-80.
　　[4] 杜琼，刘苑，赵滢，等.基因芯片检测人乳头瘤病毒基因分型在宫颈病變筛查中的临床应用价值[J].国际检验医学杂志，2016，37（23）：3303-3305.
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　　[6] 江卫红，范世珍，莫莉，等.深圳市福田区18749例妇女宫颈人乳头瘤病毒分型检测结果的分析[J].中国实验诊断学，2017，21（7）：1201-1205.
　　[7] 张晓艳，曹云，薛乐，等.陕西延安地区妇女人乳头瘤病毒基因分型检测及人群分布特征[J].检验医学与临床，2016，13（5）：641-643.
　　[8] 吕虹，康熙雄，张国军.人乳头瘤病毒基因分型检测在30岁以下年轻妇女宫颈病变中的应用价值[J].首都医科大学学报，2016，36（4）：588-591.
　　（收稿日期：2018-12-26）
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