结直肠癌术后患者化疗前后外周血NKT及NK细胞表达分析

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　　[摘要] 目的 观察结直肠癌术后患者化疗前后外周血淋巴细胞亚群的变化，评估患者免疫功能状态变化。 方法 纳入浙江省肿瘤医院2016年1～12月住院的结直肠癌根治术后Ⅱ～Ⅲ期患者74例，健康对照组为25例同期我院就诊的非恶性肿瘤患者，采用流式细胞术分析辅助化疗第1、6、8周期前1 d外周血淋巴细胞亚群比例。 结果 结直肠癌根治术后患者外周血中CD3+（P=0.1532）、CD3+CD4+（P=0.1107）、CD3+CD8+（P=0.2576）T细胞与健康对照组比较无差异（P>0.05），而CD3+CD56+ NKT细胞（P=0.0210）及CD3-CD56+ NK细胞（P=0.0045）较健康对照者显著升高（P<0.05）。术后辅助化疗6周期前NK、NKT细胞比例均无显著变化，P>0.05。8周期前NKT细胞比例无显著变化（P>0.05），NK细胞比例仅轻度下降（19.10±4.63 vs 20.31±4.66，P=0.046）。 結论 结直肠癌根治术后患者NK及NKT细胞比例较健康人显著升高，且辅助化疗后表达率保持稳定。
　　[关键词] 结直肠癌;淋巴细胞亚群;NK细胞;NKT细胞
　　[中图分类号] R730.4          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）10-0086-04
　　Expression of peripheral blood NKT and NK cells in postoperative colorectal cancer patients before and after chemotherapy
　　SHI Zhong YU Xiaofu ZHU Jing YUAN Meiqin LV Wangxia FENG Tingting ZHONG Haijun
　　Department of Abdominal Oncology， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou   310022， China
　　[Abstract] Objective To observe the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with postoperative colorectal cancer before and after chemotherapy， and to evaluate the changes of immune function status. Methods 74 patients with stage Ⅱ-Ⅲ colorectal cancer after radical resection admitted in Zhejiang Cancer Hospital from January to December 2016 were enrolled. 25 non-malignant patients in the same period in our hospital were selected as the control group. Flow cytometry was used to analyze the proportion of peripheral blood lymphocyte subsets at one day before the first， sixth and eighth cycles of adjuvant chemotherapy. Results There were no differences in CD3+（P=0.1532）， CD3+CD4+ （P=0.1107）， CD3+CD8+ （P=0.2576） T cells in the peripheral blood between patients with colorectal cancer after radical operation and control group（P>0.05）. While CD3+CD56+ NKT cells （P=0.0210） and CD3-CD56+ NK cells （P=0.0045） in the patients with colorectal cancer after radical operation were significantly higher than those of the control group （P<0.05）. There was no significant change in the proportion of NK and NKT cells before 6 cycles of postoperative adjuvant chemotherapy（P>0.05）. There was no significant change in the proportion of NKT cells before 8 cycles （P>0.05）， and the proportion of NK cells only decreased slightly（19.10±4.63 vs 20.31±4.66，P=0.046）. Conclusion The proportion of NK and NKT cells in patients with colorectal cancer after radical resection was significantly higher than that in healthy people， and the expression rate remains stable after adjuvant chemotherapy. 　　[Key words] Colorectal cancer; Lymphocyte subsets; NK cells; NKT cells
　　结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是欧美国家最常见的恶性肿瘤之一，在中国，随着经济发展及饮食结构的变化，发病率亦逐年递增，2015年发病率和死亡率均位于所有恶性肿瘤的第5位，严重危害居民的健康[1]。手术仍是早中期结直肠癌的主要治疗手段，而术后辅助化疗目前是高复发风险（Ⅲ期及部分Ⅱ期）结直肠癌的标准治疗。近年来，越来越多的研究发现免疫细胞在恶性肿瘤发展的不同阶段（起始到转移扩散到生长）中起到了控制肿瘤的作用[2]。而手术及放化疗对免疫系统的“破坏”，是一部分患者抗拒手术及化疗的主要顾虑。目前认为，参与抗肿瘤的细胞免疫的效应细胞主要有T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞等，CD3+ T细胞主要参与特异性免疫，而NK、NKT细胞参与固有免疫（非特异性免疫）。外周血淋巴细胞亚群分析能从一定程度上反应机体的免疫状态。为评估结直肠癌患者术后及辅助化疗后抗肿瘤免疫反应状态，本研究对74例结直肠癌患者外周血淋巴细胞亚群的动态变化作了观察，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　收集浙江省肿瘤医院2016年1～12月于大肠外科住院手术，并之后于腹部肿瘤内科行辅助化疗的结直肠癌患者。纳入标准：（1）所有患者均经手术病理确诊为结肠癌或直肠癌（其中直肠癌患者为高位直肠癌，手术前后未行放疗）;（2）病理分期为Ⅱ～Ⅲ期，影像学检查未发现其他远处转移;（3）既往无其他恶性肿瘤手术、化疗或放疗史;（4）年龄18～75岁，ECOG评分0～1分;（5）无其他严重并发症和化疗禁忌证;（6）排除合并肺结核、肝炎和艾滋病等传染性疾病以及免疫系统相关疾病的患者。
　　根据纳入标准选取患者共74例，其中男38例，女36例。年龄26～71岁，中位年龄55岁。右半结肠癌28例，左半结直肠癌46例。免疫组化错配修复蛋白（mismatch repair，MMR）检测为错配修复缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）6例，錯配修复完全（mismatch repair proficient，pMMR）63例，未检测5例。其中根据2017年UICC-AJCC临床分期第8版分为ⅡB期20例，ⅡC期1例，ⅢA期5例，ⅢB期31例，ⅢC期17例。病理类型：均为腺癌，其中黏液腺癌7例。分化程度：高-中分化1例，中分化57例，中-低分化12例，低分化4例。74例患者术后均无化疗禁忌。
　　所有患者均术后3～4周内给予辅助化疗，其中XELOX方案化疗69例，卡培他滨口服化疗2例，mFolfox6方案化疗3例。
　　健康对照组为25例同期我院就诊的非恶性肿瘤患者，且未合并肺结核、肝炎和艾滋病等传染性疾病以及免疫系统相关疾病。其中男12例，女13例。年龄23～70岁，中位年龄52岁。健康对照组与肠癌组患者的年龄、性别具有可比性（P>0.05）。
　　1.2 标本采集及检测
　　所有患者于术后第1次化疗前、第6、8次化疗前1 d抽取空腹静脉血5 mL，检测外周静脉血中相关淋巴细胞亚群的比例。
　　1.2.1 试剂及仪器  CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5四联标记单克隆抗体﹑CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5四联标记单克隆抗体﹑OptiLyse C溶血素﹑Immuno-Trol全血质控品及仪器光路流路校正品Flowcheck。采用FC500流式细胞仪（flow cytometry method，FCM）分析。以上试剂及仪器均来自美国Beckman Coulter公司。
　　1.2.2 流式细胞检测及分析  采用肝素钠抗凝全血进行荧光标记，100 μL全血分别与10 μL CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5四联标记单克隆抗体或CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5四联标记单克隆抗体，室温避光孵育15 min，OptiLyse C溶血素溶血后避光孵育15 min，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤一次，最后用500 μL PBS重悬细胞待FCM分析。每次检测均用Immuno-Trol进行全程质控。所有测定随常规样本分析进行。采用CXP Analysis分析系统，根据检测需要设计方案中所需的散点图﹑直方图。采用同型对照抗体确定线性门的位置和检测方案电压;在电压确定的基础上进行颜色补偿：去掉两种荧光的发射光谱中重叠部分，确保所检测荧光表达的准确性。针对前向散射（forward scatter，FS）与侧向散射（side scatter，SS）细胞分群所得淋巴细胞进行分析，在相应的直方图的散点图中读取相应CD分子的阳性表达率。每次分析前用Flowcheck进行仪器光路和流路的校正，保证FS和各荧光通路的半高峰变异均<2%;并采用Immuno-Trol质控品进样本检测的质量控制。
　　1.3 统计学方法
　　统计由SPSS 15.0及Microsoft Office Excel 2007软件完成。计量资料以（x±s）表示，成组资料两样本均数比较用双尾t检验，化疗前后指标比较采用双尾配对t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 结直肠癌术后患者与健康人外周血淋巴细胞亚群表达率比较
　　肠癌根治术后患者外周血中CD3+（总T细胞）（P=0.1532）、CD3+CD4+（辅助/效应T细胞）（P=0.1107）、CD3+CD8+（抑制/细胞毒T细胞）（P=0.2576）T细胞与健康对照组比较无差异（见表1）。而CD3+CD56+ NKT细胞（P=0.0280）及CD3-CD56+ NK细胞（P=0.0039）较健康对照者显著升高。见表1。 　　2.2 结直肠癌患者术后辅助化疗前后外周血NKT细胞及NK细胞表达率分析
　　剔除了15例未完成全部辅助化疗的患者（12例为XELOX方案，3例为mFolfox6方案），余59例患者均完成了7～8周期的XELOX方案或卡培他滨方案化疗，对这59例患者进行分析（其中6例患者第8周期化疗前1 d验血发现血小板Ⅲ°减少等化疗禁忌，未行第8周期化疗）。考虑6个月（一般为8周期XELOX方案或卡培他滨方案）的辅助化疗（Ⅲ期T1-3N1低危患者可3个月）为肠癌术后标准治疗，本文主要研究标准治疗后的患者免疫状态;并结合文献中的方法及数据结果[3]，我们对患者第6、8周期化疗前1 d的外周血进行分析（mFolfox6方案患者拟分析8、12周期前1 d，但患者均未完成治疗）。肠癌患者术后辅助化疗6周期前NK、NKT细胞比例均无显著变化（P>0.05）（表2）。8周期前NKT细胞比例无显著变化（P>0.05），NK细胞比例仅轻度下降（19.10±4.63 vs. 20.31±4.66，P=0.0431）。见表2。
　　3 讨论
　　肿瘤细胞对宿主的适应是肿瘤进展、治疗失败以及机体最终死亡的一个重要原因。转化的细胞不断的面临免疫选择，能在免疫攻击下存活的细胞被保留，而不能逃避免疫攻击的则被清除[4，5]。参与抗肿瘤的细胞免疫的效应细胞主要有T细胞、NK细胞、NKT细胞等，CD3+T细胞主要参与特异性免疫，而NK及NKT细胞均为体内抗肿瘤固有免疫反应的重要细胞。本研究发现在结肠癌根治术后患者的外周血中，CD3+（总T细胞）、CD3+CD4+（辅助/效应T细胞）、CD3+CD8+（抑制/细胞毒T细胞）T细胞比例与健康人无显著性差异;而CD3+CD56+ NKT细胞及CD3-CD56+ NK细胞比例均较健康人显著升高，且保持稳定不受辅助化疗影响，提示我们固有免疫可能在这类患者中发挥更重要的作用。
　　固有样T细胞是一类非肽类识别的T细胞，是哺乳动物T细胞的一个重要组成部分。最近的一些研究表明这些固有样T细胞在调节肿瘤免疫反应中发挥重要作用，因而潜在可用于肿瘤免疫治疗的开发。而肿瘤免疫中最具代表性的固有样T细胞亚群为NKT细胞[6，7]。一方面，NKT 细胞可通过 Fas/FasL 途径、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α途径以及穿孔素途径发挥直接抗肿瘤作用[8]，且多项研究报道了NKT细胞在体外能有效杀伤白血病、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、恶性黑色素瘤等多种血液或实体肿瘤细胞株[9]。另一方面，根据是否对α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide，α-GalCer）/CD1d 复合体发生反应，NKT 细胞被分为经典NKT细胞（invariant NKT， iNKT或Ⅰ型 NKT）和非经典NKT细胞（variant NKT， vNKT或Ⅱ型 NKT）[10]。iNKT细胞被激活后主要分泌干扰素（interferon，IFN）-γ、白介素（interleukin，IL）-2等T辅助细胞（T helper cells，Th）1类细胞因子，在肿瘤免疫中主要起到抗肿瘤作用;vNKT细胞激活后主要分泌如IL-13、IL-4等Th2类细胞因子，在肿瘤免疫中主要发挥抑制作用，形成双向免疫调节模式[11，12]。综上所述，NKT细胞既是一种重要的固有免疫效应性细胞，也作為免疫调节细胞参与适应性免疫应答。本研究发现肠癌术后患者外周血NKT细胞比例显著高于健康人，提示肠癌患者中NKT细胞介导的肿瘤免疫反应处于活化状态。考虑到NKT细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用为双向调节，且多个研究发现肿瘤患者的iNKT细胞数目减少且功能缺失[13]，因此，这种活化是否有利还难以下定论。如进一步分析这些患者外周血中NKT的分型，将能更明确阐述其肿瘤免疫反应状态。
　　NK细胞是固有免疫的主要效应细胞之一，其不需要主要组织相容性复合体的抗原提呈，就可识别和杀死肿瘤细胞[14]。一方面，NK细胞可以通过分泌穿孔素（Perforin）和颗粒酶B（Granzyme B）等直接裂解并杀伤肿瘤细胞;另一方面，还可以通过分泌IFN-γ等细胞因子，参与免疫调控而促进抗肿瘤免疫反应[15]。有研究发现转移性结直肠癌患者中NK细胞活性强的患者治疗缓解率更高，无进展生存期（progression free survival，PFS）更长[16]。本研究发现肠癌术后患者外周血NK细胞比例显著高于健康人，但未发现NK细胞比例与肿瘤患者临床及分子病理特征之间的关系，有待更全面的研究及生存随访数据来全面阐述NK细胞比例升高的意义。
　　本文研究还存在如下一些局限性。已有研究表明，dMMR肠癌患者肿瘤组织有更多的免疫细胞浸润[17，18]，左右半结肠的分子生物学特征及免疫状态也有很大差异，但本研究从MSI状态与肿瘤部位两个角度进行分层分析（数据未列出），均未发现有差异，可能与样本量不足有关。本研究选取的对象为肠癌根治术后患者，与肿瘤负荷大的术前或者晚期患者相比可能免疫反应状态有差异，化疗对免疫状态的影响也有差异[19]。另外，已有些个案报道发现高NK细胞比例的晚期肠癌患者治疗后获得临床完全缓解以及长期生存[20]，而研究对象中也有数例患者NK或者NKT比例明显高于正常标准。由于时间所限，研究中的患者目前还未能获得复发生存相关的随访数据，如对这部分患者进行跟踪随访，可能为NK或NKT细胞高表达与预后的关系提供更重要的临床证据。
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