香舒丸急性毒性和长期毒性研究

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　　【摘 要】 目的：在動物上评价香舒丸的急性毒性和长期毒性，为临床安全用药提供参考依据。方法：急性毒性试验中，设置对照组和给药组，每组各10只雌性小鼠。给药组以香舒丸能通过灌胃针的最大药液浓度（7.26 g·mL-1）、小鼠最大灌胃体积（0.04mL·g-1），在24h内2次给予小鼠。观察并记录给药后14d内的死亡情况、毒性反应、体重、摄食量，观察期结束后，检测血液生化学指标，肉眼检查各主要脏器组织病变情况，计算脏器系数和最大给药量。长期毒性试验中，设置香舒丸11g·kg-1组、22g·kg-1组、44g·kg-1组和对照组，每组各20只雌性大鼠。连续给药13周及恢复4周，记录大鼠的一般表现、体重、摄食量。给药及恢复期结束后，检测大鼠血液学指标、血液生化学指标，肉眼检查各主要脏器组织病变情况，计算脏器系数，并观察脏器组织病理学变化。结果：急性毒性试验中，给药组小鼠的一般表现正常，体重、摄食量、血液生化学、脏器系数差异无统计学意义（P>0.05），肉眼检查各主要脏器组织无明显病变，小鼠最大给药量为580.8g·kg-1。长期毒性试验中，香舒丸3个剂量组给药13周后及恢复4周后，大鼠的一般表现正常，体重、摄食量、血液学指标及脏器系数差异无统计学意义（P>0.05）。给药13周后，香舒丸44g·kg-1组Urea显著升高、Crea显著降低（P<0.01），但均在本实验室正常生理值范围内，44g·kg-1组1例肾脏出现轻微矿化;恢复4周，指标恢复正常，其他血生化指标无显著性改变，香舒丸组脏器或组织未发生明显病理改变。结论：香舒丸对雌性小鼠、大鼠未见明显的急性毒性及长期毒性，提示香舒丸在临床推荐剂量下服用是安全的。
　　【关键词】 香舒丸;临床前安全性评价;急性毒性;长期毒性
　　【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2019）24-0027-07
　　Study on Acute and Long-Term Toxicity of Xiangshu Pill
　　JIAO Linna1 FU Manling2 HAI Neiyou3 JIANG Baoxiang1 KE Hui1 XU Xiaoyu1*
　　1.Pharmacology of Chinese Materia Medica， Southwest University， Chongqing 400715， China; 2. Nursing equipment research and development laboratory of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China; 3. Luzhou xinkang biotechnology co， Luzhou 646000， China
　　Abstract：Objective To evaluate the acute toxicity and long-term toxicity of Xiangshu Pill in animals to provide reference for clinical safety drugs.Methods In acute toxicity test， there were control group and administration group and 10 female mice in each group. Mice were administered intragastrically twice within 24 hours. The concentration of Xiangshu Pill in the administration group was 7.26g·mL-1， and the volume was 0.04mL·g-1. Mortality， toxicity， body weight and food intake within 14 days after administration were observed and recorded. After the end of the observation period， blood biochemical indicators were detected， pathological changes of main organs were examined by naked eye， and organ coefficients and maximum dosage were calculated. In long-term toxicity test， there were Xiangshu Pill 11g·kg-1 group， 22g·kg-1 group， 44g·kg-1 group and control group， consisted of 20 female rats in each group. During 13 weeks of continuous administration and 4 weeks of recovery， the general performance， body weight and food intake of rats were recorded. After the administration and recovery period， the hematological and biochemical indexes of rats were detected. The pathological changes of the main organs were examined by naked eye. The organ coefficients were calculated and the histopathological changes of the organs were observed.Results In acute toxicity test， the mice in the administration group showed normal general performance， and there was no significant difference in body weight， food intake， blood biochemistry and organ coefficient（P>0.05）. There was no obvious pathological change in the main organ by naked eye examination. The maximum dosage of the mice was 580.8g·kg-1. In long-term toxicity test， after 13 weeks of administration and 4 weeks of recovery， the rats in the three dosage groups of Xiangshu Pill showed normal general performance. There was no significant difference in body weight， food intake， hematological parameters and organ coefficient （P>0.05）. After 13 weeks of administration， Urea increased significantly and Crea decreased significantly in Xiangshu Pill 44g·kg-1 group（P<0.01）， but within the normal physiological value of the laboratory and one case of kidney in 44g·kg-1 group had slight mineralization. After 4 weeks， the indexes recovered normal， other blood biochemical indicators had no obvious changes， and viscera or tissues in Xiangshu Pill group had no obvious pathological changes. Conclusion Xiangshu Pill had no obvious acute toxicity and long-term toxicity to female mice and rats， suggesting that it was safe to take Xiangshu Pill at the recommended clinical dosage. 　　Key words：Xiangshu Pill;Preclinical Safety Evaluation;Acute Toxicity;Long-Term Toxicity
　　香舒丸，由香附、当归、漏芦、王不留行、夏枯草等中药组成，具有疏肝解郁、活血化瘀、软坚散结、理气镇痛的功效，主治肝郁气滞、血瘀痰凝型乳腺增生。该方在临床上应用二十余年，能够减轻乳房疼痛、减小乳房肿块及调节性激素水平等，但香舒丸的毒理学研究目前尚无文献报道。本研究依据《药物非临床研究质量管理规范》[1]《药物单次给药毒性研究技术指导原则》[2]《药物重复给药毒性研究技术指导原则》[3]等进行香舒丸的急性毒性和长期毒性试验， 为临床安全用药提供实验依据。
　　1 材料
　　1.1 药物与试剂 香舒丸，批号K170601，10g/袋，由四川绿叶制药股份有限公司提供。临床人每日推荐剂量为22g·60kg-1。用蒸馏水配制香舒丸能通过灌胃针的最大浓度7.26g·mL-1用于急毒试验中的给药组;配制浓度为1.1g·mL-1、2.2g·mL-1及4.4g·mL-1分别用于长毒试验中的香舒丸11g·kg-1、22g·kg-1、44g·kg-1组，此三个剂量分别为临床推荐剂量的30、60、120倍。
　　血液生化检测试剂盒：天冬氨酸氨基转移酶（AST，批号：140217011），丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号：140117013），碱性磷酸酶（ALP，批号：140317009），尿素（Urea，批号：141317010），肌酐（Crea，批号：141017010），总蛋白（TP，批号：140817009），白蛋白（ALB，批号：140917006），葡萄糖（Glu，批号：141517008），总胆固醇（T-CHO，批号：141617010），三酰甘油（TG，批号：141717012），肌酸磷酸激酶（CK，批号：142517009），购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;电解质分析仪校正液（批号：20190108），购自上海迅达医疗仪器有限公司;溶血剂（批号：20171021）、稀释液（批号：111102），购自上海东湖仪器试剂科技有限责任公司，所有试剂均在有效期内使用。
　　1.2 仪器 5417R型台式低温离心机（德国Eppendorf公司），BS-220型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），XFA6130型全自动血液细胞分析仪（南京普朗医疗设备有限公司），XD-685型电解质分析仪（上海迅达医疗仪器有限公司），ASP300型组织脱水机、EG1150H型石蜡包埋机、RM2235型组织切片机、ST4040型半自动染色机、DM4000型电子显微镜（德国Leica仪器有限公司）。
　　1.3 动物   SPF级KM小鼠20只，雌性，体质量（20±2）g，购于重庆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2017-0001，实验动物质量合格证号No.0005059;SPF级SD大鼠80只，雌性，体质量（200±20）g，购于重庆市中药研究院，实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2017-0006，实验动物质量合格证号No. 0005115。飼养于西南大学药学院实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK （渝）2014-0002。温度20～25℃，相对湿度：40%～60%，光照12h/12h明暗交替。
　　2 方法
　　2.1 急性毒性试验[2，4-5] 预试验中因受药物浓度及小鼠最大给药容积的影响，给药后小鼠未出现死亡，无法计算出香舒丸对小鼠的半数致死量（LD50） 及最大耐受量，故正式试验进行最大给药量试验。取雌性小鼠20只，随机分为对照组和给药组，每组10只。以能通过16号灌胃针的最大浓度7.26g·mL-1、最大灌胃体积0.04mL·g-1给药，给药2次，间隔12h，对照组给予等体积蒸馏水，给药后即刻观察药物的毒性反应及死亡情况。连续观察14d，记录小鼠的毒性反应、死亡情况、体重及摄食量，观察期结束后，进行血液生化学检测，肉眼检查各主要脏器组织病变情况，计算脏器系数[脏器系数=脏器重（g）/体重（g）×100%]和最大给药量。若给药组的脏器组织的大小、颜色、质地与正常脏器有所差异，应进一步进行病理组织学检查。
　　2.2 长期毒性试验[3-6] 取雌性SD大鼠80只，随机分为对照组、香舒丸11g·kg-1组、22g·kg-1组和44g·kg-1组（分别相当于临床剂量的30、60、120倍），每组各20只。连续灌胃给药13周，每日1次，给药容积0.01mL·g-1。对照组给予等体积蒸馏水。每日观察大鼠的一般表现，每周测大鼠体重、摄食量。给药13周后，每组各随机取10只大鼠，检测血液学及血液生化学指标，观察脏器大体形态学，称重、计算脏器系数，观察并记录对照组和香舒丸44g·kg-1组脏器组织病理学变化。余下大鼠停药正常喂养4周，恢复期结束后，检测指标与上述指标相同。
　　2.3 统计学处理 所得数据采用IBM SPSS Statistics 20统计软件进行分析，以（x±s）表示各指标的平均值和离散程度。组间数据比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 急性毒性试验 连续观察14d，无小鼠死亡，未出现明显中毒反应，自主活动、呼吸、饮食、粪便等均未见异常，无脱毛及皮毛颜色改变，眼、口、鼻未见分泌物。与对照组相比，给药组小鼠体重（如图1所示）、摄食量（如图2所示）、血液生化学指标（ALT、AST、ALP、ALB、TP、Glu、Crea、Urea、TG、T-CHO、CK，见表1）、脏器系数（脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢，见表2）差异无统计学意义（P>0.05）。肉眼观察主要脏器（脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢、乳腺、胃、小肠、大肠等） 的位置、形状、大小、色泽、质地等均未见明显异常。由灌胃最大浓度7.26g·mL-1、最大体积0.04mL·g-1，给药2次，得小鼠的最大给药量为580.8g·kg-1，该剂量相当于人临床每日推荐用量的1584倍。 　　2 长期毒性试验
　　2.1 香舒丸对大鼠一般表现的影响 连续给药13周及恢复4周，未见大鼠死亡，未出现明显中毒反应，各组大鼠试验期间自主活动、呼吸、饮食、粪便未见明显异常，无脱毛及皮毛颜色改变，鼻、口腔、眼、生殖器等未见异常分泌物。
　　2.2 香舒丸对大鼠体重和摄食量的影响 各组大鼠体重逐周增加，摄食量变化趋势相同。连续给药13周及恢复4周，与对照组相比，各给药组大鼠体重、摄食量差异无统计学意义（P>0.05）。如图3、4所示。
　　2.3 香舒丸对大鼠血液学指标的影响 连续给药13周及恢复4周，与对照组相比，各给药组大鼠血液学指标（RBC、HGB、PLT、HCT、MCH、MCV、MCHC、WBC）均差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
　　2.4 香舒丸对大鼠血液生化学指标的影响   连续给药13周，与对照组相比，各给药组血液生化学指标（ALT、AST、ALP、ALB、TG、TP、T-CHO、CK、Glu、K+、Na+、Cl-）差异均无统计学意义（P>0.05），其中香舒丸44g·kg-1组Urea显著升高、Crea显著降低（P<0.01），且随着剂量的增加而分别呈上升、下降趋势，但都在大鼠的正常生理值范围内[4];恢复4周，各给药组血液生化学指标差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。
　　2.5 香舒丸对大鼠大体形态学的影响 给药13周及恢复4周，对照组与香舒丸44g·kg-1组受检脏器及组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢、乳腺、胃、小肠、大肠）的位置、形状、大小、色泽、质地等均未见明显异常。
　　2.6 香舒丸对大鼠脏器系数的影响 给药13周及恢复4周，与对照組相比，各给药组大鼠的脏器系数（脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢）均无显著性差异（P>0.05），见表5。
　　2.7 香舒丸对大鼠脏器组织的影响 给药13周，香舒丸44g·kg-1组仅1例肾脏轻微矿化，见图5。对照组与香舒丸44g·kg-1组其他脏器或组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢、乳腺）均未发生明显病理改变。恢复4周，对照组与香舒丸44g·kg-1组脏器或组织均未发生明显病理改变。
　　3 讨论
　　急性毒性试验中，由于预试验受香舒丸浓度及小鼠灌胃体积的限制，无法测出香舒丸对小鼠的半数致死量（LD50）、最大耐受量（MTD），故采用最大给药量法进行急性毒性试验。为了更全面的显示香舒丸可能存在的急性毒性，除记录了《中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则》所规定的一般状况、体重、摄食量、大体解剖等外，又增加了血液生化学以及脏器系数的检测。结果显示，与对照组相比，灌胃香舒丸的小鼠的各项指标均无显著性变化，且最大给药量为580.8g·kg-1，相当于人临床每日推荐用量的1584倍，表明香舒丸对小鼠无明显的急性毒性反应，可供临床使用[7]。
　　长期毒性试验中，给药13周后，香舒丸44 g·kg-1组大鼠Urea显著高于对照组、Crea显著低于对照组，但其数值均在实验室大鼠血生化指标正常生理值范围内，且Crea的降低无临床实际意义，组织病理学检查中仅1例肾脏出现轻微矿化，其他脏器及组织未出现明显的病理变化，无统计学及毒理学评价意义，考虑为个别大鼠自发性病变;恢复4周后该组大鼠Urea、Crea水平与对照组无显著差异，且各脏器及组织未出现明显的病理变化。从总体来看，香舒丸各剂量未对给药期及恢复期大鼠的一般表现、体重、摄食量、血液学指标、血液生化学指标、系统尸检、脏器系数及组织病理学等指标产生与药物毒性相关的异常变化。提示在本试验条件下， 香舒丸对大鼠无明显的蓄积毒性及延迟毒性作用。
　　香舒丸在临床上治疗肝郁气滞、血瘀痰凝型乳腺增生具有良好的效果。同期试验也表明，香舒丸能够减轻乳腺增生模型大鼠的乳房肿胀、调节性激素水平及相关蛋白的表达、减轻乳腺组织的增生等。本试验中，香舒丸对雌性小鼠、大鼠均未见明显的急性毒性及长期毒性反应，表明香舒丸在临床推荐剂量下服用是较安全的。因此，该处方在临床上值得进一步临证推广应用。同时，将该处方开发为治疗乳腺增生疾病的中成药制剂也具有极大的必要性。
　　参考文献
　　[1]国家食品药品监督管理总局.药物非临床研究质量管理规范（总局令第34号） [S]. 2017.
　　[2] 国家食品药品监督管理总局.药物单次给药毒性研究技术指导原则[S].2014.
　　[3] 国家食品药品监督管理总局.药物重复给药毒性研究技术指导原则[S].2014.
　　[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社， 2011：121-132.
　　[5] 魏伟， 吴希美， 李元建.药理实验方法学[M].4版.北京：人民卫生出版社， 2010：393-406.
　　[6] 袁伯俊， 廖明阳， 李波.药物毒理学实验方法与技术[M].北京：化学工业出版社， 2007：212-231.
　　[7] 谢秀琼， 张世臣.中药新制剂开发与应用[M].3版.北京：人民卫生出版社， 2006：742.
　　（收稿日期：2019-10-10 编辑：刘斌）
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