慢性心肌缺血不同造模方式的比较

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　　[摘要]目的 比较两种不同慢性心肌缺血造模方式之间的差异及优劣情况。方法 选取雄性ICR小鼠30只，根据造模方式的不同分为皮下注射组、缓释泵释放组、正常对照组，每组各10只。皮下注射组于小鼠腰背部皮下注射异丙腎上腺素（ISO）30 mg/（kg·d），连续注射14 d;缓释泵释放组于小鼠腰背部皮下埋入微量缓释泵，ISO释放量30 mg/（kg·d）;正常对照组小鼠皮下注射等剂量生理盐水。采用心肌酶谱、心脏切片TTC染色等指标衡量小鼠的心肌缺血程度。结果 皮下注射组与缓释泵释放组小鼠的造模死亡率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;皮下注射组与缓释泵释放组小鼠的心脏心肌肥大指数高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组与缓释泵释放组小鼠的心肌肥大指数比较，差异无统计学意义（P>0.05）;缓释泵释放组小鼠的心肌缺血面积百分比高于皮下注射组，差异有统计学意义（P<0.05）;缓释泵释放组小鼠的心肌酶谱各项指标和肌钙蛋白（cTnT）水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组小鼠的血清α-羟丁酸脱氧酶（α-HBDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及同工酶（mAST）、cTnT水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组小鼠的血清肌酸激酶（CK）及同工酶（CK-MB）、乳酸脱氧酶（LDH）水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;缓释泵释放组与皮下注射组小鼠的心肌酶谱各项指标及cTnT水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 皮下注射及缓释泵释放ISO两种方式均可以造成小鼠心肌肥大，缓释泵释放则能更大程度上诱导小鼠出现心肌缺血，缓释泵释放同时在更大程度上造成了心肌功能的损伤。
　　[关键词]慢性心肌缺血;异丙肾上腺素;缓释泵;皮下注射;小鼠
　　[中图分类号] R541          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）2（b）-0007-05
　　[Abstract] Objective To compare the differences and advantages between different methods of chronic myocardial ischemia. Methods Thirty male ICR mice were selected and divided into subcutaneous injection group， sustained-release pump release group and control group according to different modeling methods， with 10 rats in each group. In the subcutaneous group， Isoproterenol （ISO） 30 mg/（kg·d） was injected subcutaneously into the lumbar back of the mice for 14 days. The release pump group was placed subcutaneously in the lumbar back of the mice. The ISO release amount was 30 mg/（kg·d）. The control group was injected subcutaneously with an equal dose of physiological saline. Myocardial ischemia was measured by myocardial zymogram and heart section TTC staining. Results There was no significant difference in the mortality between the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group （P>0.05）. The cardiac hypertrophy index of the mice in the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group was higher than that in the normal control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the cardiac hypertrophy index between the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group （P>0.05）. The myocardial ischemic area of the mice in the sustained-release pump release group was higher than that of the subcutaneous injection group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The myocardial enzymes and cardiac troponin T （cTnT） level of the mice in the sustained-release pump release group were higher than those in the normal control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of α-hydroxybutyrate deoxygenase （α-HBDH）， aspartate aminotransferase （AST）， isozyme （mAST） and cTnT in the subcutaneous group were higher than those in the normal control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. While the levels of creatine kinase （CK） and isoenzyme （CK-MB） and lactate deoxygenase （LDH） in the subcutaneous group were not significantly different from those of the normal control group （P>0.05）. There was no significant difference in myocardial zymogram and cTnT between the sustained-release pump release group and the subcutaneous injection group （P>0.05）. Conclusion Both subcutaneous injection and sustained release pump release ISO can cause myocardial hypertrophy in mice， sustained release pump can induce myocardial ischemia in mice to a greater extent， and sustained release pump also causes damage to myocardial function to a greater extent. 　　[Key words] Chronic myocardial ischemia; Isoproterenol; Sustained release pump; Percutaneous injection; Mice
　　心血管疾病是我国导致居民死亡的第一病因，而且患病率仍将持续增加[1]，因此，研究心血管疾病的病因和发病机制对于提高人民的健康水平、延长寿命具有重大意义[2]。心肌缺血（myocardial ischemia）是指由于心脏出现生理或病理性的血液灌注减少，从而导致心脏相应的供氧减少，最终引起心肌能量代谢异常，不能维持心脏正常工作状态的一种病理状态。
　　心血管疾病的康复机制研究的关键技术之一是复制心肌缺血动物模型。建立适当的动物模型，不仅为该病的发病机制和病理生理改变提供重要的资料，更重要的是能够促进新药的开发，推进临床诊断的各种治疗方法的进步。据文献报道，皮下注射大剂量异丙肾上腺素（Isoproterenol，ISO）会导致大小鼠急性心肌缺血损伤[3-7]，这种损伤与人的急性心肌缺血较为相似， 故可作为评价药物抗心肌缺血的动物模型[8]。ISO的作用机制为兴奋β1受体，使心肌兴奋性提高、收缩加快、心率加快、代谢旺盛，增加心肌耗氧量，从而造成心脏负荷过重，同时兴奋β2受体，使外周血管扩张，回心血量减少，动脉压降低，冠脉流量减少。
　　实验研究过程中，实验动物模型应在满足与疾病相似性、重复性、可靠性等前提下，尽可能模拟人类心肌缺血疾病的发生、发展状态，可以为探求心肌缺血疾病的病因、发病机制、临床治疗提供更好的研究基础。目前，现有的心肌缺血的模型大致可以分为以下几类：急性心肌缺血模型、慢性心肌缺血模型、可控性心肌缺血模型和离体心肌缺血模型。本研究的主要目的，是比较皮下注射和皮下缓释泵释放两种给药方式下，哪种慢性心肌缺血模型的造模方式更稳定，小鼠存活率更高，心肌缺血状态更明显，从而为今后对于冠心病的研究提供可靠的动物模型。
　　1对象与方法
　　1.1 实验动物
　　本研究实验所用动物为ICR小鼠，共30只，雄性，18～22 g，SPF级，均购于浙江省医学科学院实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（浙）2019-0002。小鼠均自由摄食和饮水，适应性饲养1周左右后，开始实验操作。
　　1.2主要仪器与试剂
　　1.2.1实验试剂
　　ISO注射液（上海禾丰制药有限公司，生产批号：6E20003，规格：0.5 mg/ml）;生理盐水（江苏长江药业有限公司，批准文号：国A20070002）;水合氯醛（中国医药集团上海化学试剂公司，生产批号：20120720）。
　　1.2.2实验仪器
　　微量缓释泵（Alzet，model 1002），0.22 μm滤膜，1 ml注射器，剃毛刀，手术器械。
　　1.3实验分组及处理
　　1.3.1动物分组
　　将30只雄性ICR小鼠随机分为三组，每组各10只。正常对照组小鼠皮下注射生理盐水，10 μl/g，连续注射14 d;皮下注射组小鼠皮下注射ISO，给药量为30 mg/（kg·d）[9]，10 μl/g，连续注射14 d;缓释泵释放组小鼠皮下植入含有ISO的缓释泵，给药量为30 mg/（kg·d），6 μl/d，连续注射14 d，缓释泵内ISO浓度=小鼠重量×30 mg/（kg·d）×14 d/（1000×6 μl/d×14 d）。
　　1.3.2缓释泵的制备
　　1.3.2.1配制ISO溶液  使用剂量为30 mg/（kg·d），所用ISO溶液的浓度为100 mg/ml（预计小鼠重量为20 g）。①称取200 mg ISO，加入2 ml的生理盐水溶液，充分溶解;②0.22 μm滤膜过滤ISO溶液;③无菌条件下取出缓释泵，放在干净的纱布上，注意不要污染;④称量记录空泵重量，一般约为0.5 g，取出注射裝置，安装上注射管，吸取约0.2 ml的ISO溶液，左手垂直手持缓释泵，右手持注射管，垂直插到管底，缓慢推注射器，并缓慢上提注射器，直至有液体流出，擦拭掉流出的液体，并安装上pump的头部插件;⑤再次称量记录注入ISO后缓释泵的重量，两次相差应该大于90 mg，否则吸出ISO再次灌注缓释泵;⑥将缓释泵置入无菌的0.9%生理盐水中，37℃孵箱中过夜（>6 h）。
　　1.3.2.2缓释泵的植入  ①配制4%水合氯醛，麻醉小鼠，以0.2 ml/20 g剂量进行腹腔注射;②小鼠背部脱毛，酒精消毒后，于两块肩胛骨中间，与体轴呈90°剪开一个小口子，使用镊子沿着口子在小鼠背部掏一个口袋，用来放缓释泵;③将泵放入口袋中，缝合背部，并涂上青霉素钠，将小鼠放在保温垫上待完全苏醒后，放回笼中。
　　1.4观察指标及检测方法
　　1.4.1观察指标
　　在给药14 d后，①摘取小鼠眼球，取全血和血清，比较三组小鼠心肌酶谱及肌钙蛋白（cTnT）水平，心肌酶谱指标包括α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及同工酶（mAST）、肌酸激酶（CK）及同工酶（CK-MB）、乳酸脱氧酶（LDH）;②测量小鼠的体重及心脏重量，并记录，使用心肌肥大指数（HW/BW）作为衡量心脏肥大的指标[10];③心脏组织切片进行心肌缺血TTC染色;④统计小鼠死亡率。
　　1.4.2 TTC染色
　　小鼠处死后取心脏，刀片垂直心脏长轴将其横切为5～6片，每片约为2 mm。展平后置于1% TTC溶液中，37℃避光孵育20 min后置于10%中性甲醛（0.1 mol/L PBS配制）中。于染色后第1周对4个横切片的正反两面进行图像采集，照片采用Photoshop 3S Extended软件计算心肌缺血面积。心肌缺血面积百分比（%）=心肌缺血面积/横切片总面积×100%[11]。 　　1.5统计学方法
　　采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1皮下注射组与缓释泵释放组小鼠造模死亡率的比较
　　给药14 d后，皮下注射组小鼠存活8只，死亡2只，死亡率为20%;而缓释泵释放组小鼠存活10只，无死亡，死亡率为0%。皮下注射组与缓释泵释放组小鼠的造模死亡率比较，差异无统计学意义（χ2=2.222，P=0.136）。
　　2.2三组小鼠心脏肥大及心肌缺血情况的比较
　　皮下注射组与缓释泵释放组小鼠的HW/BW高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组与缓释泵释放组小鼠的HW/BW比较，差异无统计学意义（P>0.05）;缓释泵释放组小鼠的心肌缺血面积百分比高于皮下注射组，差异有统计学意义（P<0.01）（表1、图1）。
　　2.3三组小鼠心肌酶谱及cTnT水平的比较
　　缓释泵释放组小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST、CK及CK-MB、LDH水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组小鼠的血清CK、CK-MB、LDH水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;皮下注射组与缓释泵释放组的心肌酶谱各项指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。缓释泵释放组与皮下注射组小鼠的cTnT水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组与缓释泵释放组的cTnT水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。
　　3讨论
　　心血管疾病现如今已成为威胁人类生命健康的最主要的疾病之一，而心肌缺血性疾病又是在心血管疾病总发病率中占比较高的一类疾病。心血管疾病的相关基础研究的难点之一就是建立合适可重复的心肌缺血动物模型。建立适当的动物模型，不仅能为该病的发病机制和病理生理改变的研究奠定基础，更重要的是能推动新药的开发，促进临床诊断和各种治疗方法的进步。在已有文献报道的心肌缺血模型中，动物种类和造模方法较多，应用不同动物建立的心肌缺血模型具有不同特点，因此建议根据研究实验的要求选择适当的动物和造模方法[12]。
　　ISO是一种非特异性β-肾上腺素受体激动剂，在小鼠心肌缺血、心脏肥大等病理模型中应用广泛[6]。有文献报道显示，皮下注射大剂量ISO会导致大小鼠急性心肌缺血损伤[6-7]，这种损伤的病理变化与人的急性心肌缺血病理过程较为相似，因此可以应用其来进行心肌缺血动物模型的药效评价。且有研究显示，在小鼠腰背部皮下包埋微量缓释泵，给予ISO剂量分别为0.3、3、30 mg/（kg·d），2周后均可以诱导出心肌缺血及心脏肥大[13]。另有学者报道称，于小鼠背部皮下注射ISO 5 mg/（kg·d），持续1周[14]，或者腰背部皮下包埋微量缓释泵，给予ISO 5 mg/（kg·d），持续2周[15]，也均可引起明显的心脏肥大和心肌缺血症状。
　　在前期实验中，笔者已经探索到腹腔注射ISO无法稳定成模，实验动物在实验中期即会呈现较高的死亡率。且相关研究显示，小鼠皮下注射ISO有一定可能性会出现皮下硬结，呈现不同程度的发硬和黑痂，并且会随着造模天数的增加，逐渐加重，最终可能影响药物吸收，无法达到有效的造模剂量，导致造模失败[16-18]。另一方面，虽然腹腔注射吸收快，但极有可能因为血液内药物浓度迅速达到高峰，导致药物单次剂量过大而造成实验动物死亡率增加[18-19]。因此，在本研究中，引入了ALzet微量缓释泵，与皮下注射ISO的造模方法进行比较。本研究结果显示，采用腰部皮下包埋微量缓释泵释放ISO 30 mg/（kg·d）或腰背部皮下注射ISO 30 mg/（kg·d）2周均可以成功诱导小鼠出现显著的心肌肥大和心肌缺血症状，这一结果与相关研究报道一致[13]。且微量缓释泵造模得到的心肌缺血状态更为严重。
　　心肌中通常存在多种心肌酶，其中包括AST、LDH及同功酶、α-HBDH和CK及CK-MB，通常将这一组与心肌损伤相关的酶合称为心肌酶谱，对心肌梗死具有重要的诊断意义[20]。LDH、CK、AST及mAST在维持心肌正常生理功能方面发挥着重要的作用。存在于组织中的LDH其活力比存在于血清中的LDH高得多，所以当出现组织坏死时，该酶即从组织中释放入血，而使血清中的酶活力升高。在正常情况下，AST存在于组织细胞内，其中心肌细胞中含量最高，血清中含量极少。当心肌细胞由于缺血而受到损伤时，细胞内的AST释放入血，使血清AST含量升高，临床一般也将其视为心肌梗死的辅助检查指标[20]。当心肌发生缺血或梗塞时，心肌受损，导致心肌细胞内的心肌酶释放入血，血液中酶活性增高，进一步造成心肌的损伤。—般认为，血清中AST、CK、LDH含量升高程度与心肌梗死程度成正相关，因此血清中LDH、AST、CK及其同工酶的活性可作为衡量心肌缺血程度的指标[20]。
　　本研究结果显示，缓释泵释放组小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST、CK及CK-MB、LDH水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST水平高于正常對照组，差异有统计学意义（P<0.05）;皮下注射组小鼠的血清CK、CK-MB、LDH水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示两组均在一定程度上造成了心肌功能的损伤，而皮下注射组对于小鼠心肌功能的损伤程度低于缓释泵释放组。
　　cTnT作为心肌细胞所特有的一种调钙蛋白，具有较高的心肌特异性，是反映心肌坏死的血清标志物，对评价心肌细胞损伤同样具有重要意义。cTnT 存在于心肌细胞的细肌丝中，是心肌肌钙蛋白复合体中的一种多肽亚单位，具有高度的心肌特异性，当缺血缺氧造成心肌细胞损伤时，细胞膜通透性增加，大量cTnT释放入血，使血清中cTnT浓度迅速升高[20]。cTnT具有入血时间早、浓度高、持续时间长等特点，对于不同程度的心肌缺血具有较高的灵敏度及特异性，在监测心肌梗死的发展、治疗及预后上具有重要意义。cTnT相比较于经典的酶学指标CK-MB具有更高的敏感性，并且诊断窗口期更宽，因此，近年来cTnT成为了心肌缺血早期和晚期诊断的重要实验室指标。 　　本研究中使用的两种造模方法具有不同的特点，皮下注射ISO相较于其他造模方法，不需要手术开腹、开胸，对实验动物损伤小，死亡率低于腹腔注射的造模方法[21]; Alzet微量缓释泵造价较高，且无法重复利用，应用该方法单次实验成本会相应提高。但微量缓释泵给药过程稳定且只需一次操作，相较于一般的手术造模方法对实验动物伤害较小，人为操作失误而引起的系统误差小，小鼠存活率高，得到的心肌缺血模型稳定且可重复。综上所述，本研究认为于ICR小鼠腰背部皮下包埋微量缓释泵，给予ISO 30 mg/（kg·d）2周，可以建立稳定显著的心肌肥大和心肌缺血模型，该方法操作简单，且能保证实验动物較高的存活率，但造价相对较高。为进一步心血管疾病的研究提供了模型参考，值得推广。
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　　（收稿日期：2019-07-25  本文编辑：闫  佩）
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