RON及其致癌型变异体RONΔ160在乳腺癌中的表达

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　　[摘要] 目的 探討RON及其致癌型变异体RONΔ160在60例乳腺癌组织中的表达特征及其在诊断、临床靶向治疗及预后判断中的潜在价值。 方法 用免疫组化、qPCR、Western blot等方法分析RON及RONΔ160在我院2016年10月～2018年1月收集的30例正常乳腺组织、30例乳腺良性肿瘤、60例乳腺癌患者及相对应的60例癌旁组织中的表达特征及其与乳腺癌临床分期、复发、组织学分型和组织转移的关系。 结果 免疫组化结果显示，RON在正常和癌旁及良性乳腺肿瘤组织中都低表达而在乳腺癌中高表达;而RONΔ160在正常和癌旁都不表达，在良性乳腺肿瘤组织中有轻微表达，而在乳腺癌中高表达。qPCR及Western blot结果与免疫组化结果一致。而结合临床分析发现RON及RONΔ160的高表达与临床分期、组织学分级及是否发生淋巴结转移相关且具有统计学差异。 结论 RON及RONΔ160的表达与乳腺癌的发生相关及与其临床分期和组织学分级及是否淋巴结转移呈正相关，是乳腺癌诊断、临床靶向治疗及预后判断的关键标志。
　　[关键词] 乳腺癌;RON;RONΔ160;临床分期
　　[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）02-0005-04
　　Expression of RON and its oncogenic variant RON Δ160 in breast cancer
　　XU Guofu   HUANG Guoqiang
　　Department of Pathology， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou   310005， China
　　[Abstract] Objective To investigate the expression characteristics of RON and its oncogenic variant RON Δ160 in 60 cases of breast cancer and their potential value in diagnosis， clinical targeted therapy and prognosis. Methods Immunohistochemistry， qPCR， Western blot and other methods were used to analyze the expression characteristics of RON and RONΔ160 in 30 normal breast tissues， 30 benign breast tumors， 60 para-breast cancer patients and 60 cases breast cancer tissues in our hospital from October 2016 to January 2018， and their relationship with clinical stage， recurrence， histological type and tissue metastasis of breast cancer. Results The results of immunohistochemistry showed that RON was lowly expressed in normal， para-breast cancer tissues and benign breast tumor tissues and highly expressed in breast cancer. RONΔ160 was not expressed in normal and para-breast cancer tissues， slightly expressed in benign breast tumor tissues， while highly expressed in breast cancer. qPCR and Western blot were consistent with the results of immunohistochemistry. Combined with clinical analysis， it was found that high expression of RON and RONΔ160 was associated with clinical stage， histological grade， and whether lymph node metastasis occurred， with statistically significant difference. Conclusion The expression of RON and RONΔ160 is positively correlated with the occurrence of breast cancer and its clinical stage and histological grade and lymph node metastasis. It is a key marker for breast cancer diagnosis， clinical targeted therapy and prognosis.
　　[Key words] Breast cancer; RON; RONΔ160; Clinical stage 　　乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，已经威胁到了越来越多女性的生活，且发病趋势年轻化。受体型酪氨酸激酶（RON）属于MET原癌基因家族成员[1]，研究表明与正常组织相比，RON在乳腺癌组织中高表达，且与乳腺癌的发生发展密切相关[2]，但具体机制不知。RON表达的变化常可以通过产生不同的mRNA剪切体、选择性转录、蛋白平截等来产生不同的剪切异构体，现已知有9种RON变异体[3]，研究显示部分與癌症的发病相关。其中RONΔ160具有诱导细胞转化、刺激肿瘤形成、促进肿瘤侵袭转移的功能，同时还能诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化及改变RON的磷酸酶活性[4，5]。由此我们猜测乳腺上皮细胞的癌变及恶化可能与RON的异型性表达相关。因此，本研究对我院2016年10月～2018年1月收集的60例乳腺癌患者及相对应的60例癌旁组织、30例正常乳腺组织及30例乳腺良性肿瘤组织用免疫组化、实时荧光定量PCR（Real-time qPCR，qPCR）、Western blot等方法对RON及致癌性变异体RONΔ160在乳腺癌组织中的表达特征，及其与乳腺癌诊断的关系、与临床的相关性进行了分析，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　收集我院2016年10月～2018年1月60例乳腺癌患者及相对应的60例癌旁组织，同时收集30例正常乳腺组织和30例乳腺良性肿瘤组织。乳腺癌患者性别女，年龄25～81岁，中位年龄51岁。肿瘤直径0.61～5.2 cm，平均3 cm。淋巴结转移35例（58%）。组织学分级：高、中级分化46例（77%），低级分化14例（23%）。临床分期：Ⅰ期4例（6.7%），Ⅱ期6例（10.0%），Ⅲ/Ⅳ期50例（83.3%）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 实验试剂  4%PFA上海翊圣，TaKaRa RNAiso试剂盒，免疫组化试剂盒碧云天，逆转录试剂盒，SYBR购自TaKaRa，抗体购自CST，荧光定量PCR仪，包埋切片机，显微镜等仪器。
　　1.2.2 免疫组化  乳腺组织经收集后4%PFA固定2 d后，用石蜡进行包埋，切成4 μm厚的切片后用于免疫组化染色。切片梯度脱蜡后，抗原修复，之后恢复室温，封闭1 h后，一抗过夜，此后以推荐浓度滴加相应二抗37℃湿盒孵育20～30 min，PBS摇床漂洗5 min×3次，3% H2O2封闭10 min去除内源性过氧化物酶。DAB显色后，苏木素复染，盐酸酒精分化后反蓝，此后用中性树脂封片。以PBS为阴性，已知RON及RONΔ160表达组织为阳性，观察着色情况。根据每张切片的阳性细胞百分数和染色强度计分的乘积来判定，<2分为阴性，2～3分为弱阳性，4～6分为阳性，>6分为强阳性。
　　1.2.3 qPCR  用TaKaRa RNAiso试剂盒来提取组织中的总RNA后用分光光度计测定总mRNA的浓度。测定外浓度后用于逆转成cDNA，所得产物用于荧光定量，20 μL体系，10 μL SYBR，上下游引物各0.5 μL，逆转录产物1 μL，双蒸水8 μL。以18 s作为内参基因。数值以（RQ=2-△△Ct）进行比较。CT=靶基因CT值-内参考基因子CT值。
　　1.3 观察指标
　　Western blot显示结果及免疫组化染色情况和qPCR的比值与临床之间的关系。
　　1.4 统计学方法
　　数据结果用SPSS12.0软件进行统计分析。计量资料采用t 检验，计数资料行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 RON及RON△160在乳腺癌组织中表达情况
　　封三图1免疫组化结果所示，RON在乳腺的正常组织、乳腺癌癌旁组织及乳腺癌良性肿瘤中的表达量较低，而在乳腺癌中呈现出明显的高表达状态;RONΔ160在正常和乳腺癌癌旁组织中不表达，在良性乳腺肿瘤组织中轻微表达，而在乳腺癌中呈高表达状态。表1的qPCR及图1的Western blot实验的结果也证实了以上在免疫组化中得到的结论。
　　表1  qPCR检测RON及RONΔ160在不同类型乳腺组织的表达量比较（x±s）
　　2.2 RON及RONΔ160的表达与乳腺癌进展的关系
　　将Western blot结果分成相应的四个等级，阴、弱、中、强。然后通过结合临床收集资料后进行分析。由表2，3可知RON及RONΔ160表达高低与乳腺癌是否发生淋巴转移相关，且RON及RONΔ160表达越高的患者，组织学分级及临床分期都越高。
　　表2、3显示，RON及RONΔ160的表达量与乳腺癌患者的发生发展密切相关，在乳腺癌患者中，两者的表达量越高预示着肿瘤的转移，同时也意味着组织学分级及临床的病理分期越高，并且三个指标都具有统计学差异（P<0.05）。
　　表2   RON在不同病理分型分级的乳腺癌样本中的表达量[n（%）]
　　表3  RONΔ160在不同病理分型分级的乳腺癌样本中的表达量[n（%）]
　　3 讨论
　　乳腺癌作为危害女性健康的首要疾病，成为表达女性主要病亡原因之一。且其近年来有发病比率升高及发病患者呈年轻化等趋势[6]。乳腺癌作为一种高度异质性肿瘤，目前的疗法是以手术为主的化疗、放疗、生物及内分泌治疗等综合疗法，但是疗效不佳。随着近年来临床研究和基础研究的相结合，科研工作者发现很多信号通路都参与到乳腺癌的发生发展过程中，如PR、HER-2、Ki-67、BRCA1、BRCA2等分子通过对不同信号通路的调控来影响乳腺癌的发病进程[7，8]，通过对乳腺癌患者这些基因的检测诊断后进行分子分型治疗，能够实现对乳腺癌患者的精准医疗同时能够有效的提高乳腺癌患者的预后生存水平[9]。而随着基础研究的深入及与临床的结合，RON与乳腺癌的关系逐渐被研究者关注。 　　RON作为一种受体型酪氨酸激酶，是MET家族的一员，首先作为一种原癌基因被认识。最先在人的皮肤角化细胞中发现，后研究表明其表达具有组织和细胞特异性，主要表达于上皮细胞。在肺泡、甲状腺等处几乎全部缺失。作为其唯一配体，巨噬细胞刺激蛋白（MSP）与其结合有关[10]，能使RON快速二聚化后影响下游信号通路从而影响细胞行为。近年来，研究表明RON的信号失常是肿瘤发生及恶化的原因之一。现已在多种癌症中发现其异常活化和异常表达，但表现形式不同，大致分为表达增高，剪切异构体的生成及与下游信号共同激活等几种形式。此外，RON与信号转导蛋白间的功能交联可导致肿瘤进展和恶变[11-12]。
　　同时基础研究表明，RON的表达对于胚胎的正常发育具有必须的作用。RON全敲转基因小鼠会死于胚胎形成期。而转录因子SP1（transcription factor Sp1，SP1）对于RON的激活具有重要的作用，SP1导致的RON的激活与肿瘤的发生发展密切相关。
　　近年来研究表明，RON在正常乳腺组织中低表达，而在50%的临床分型乳腺癌样本中高表达，且基础小鼠体内研究表明，构建RON过表达或RON受体组成性激活的转基因小鼠后乳腺组织RON表达明显增高，乳腺增生和乳腺细胞高度转移。RON过表达会导致乳腺癌的转移及复发[13]，当乳腺癌没有出现淋巴转移时，RON和c-MET之间的共表达的产生也会导致患者的預后变差，十年生存率仅11.8%，远远低于无两者表达的患者的生存率，提示我们两者可能相互协同作用，促进了乳腺癌的转移及侵袭[14]。而MSP和RON位于染色体的3p21位置，研究表明两者在癌症中，同时该基因区在包括乳腺癌在内的多种肿瘤和癌症细胞系中发生基因扩增，该扩增可能会导致MSP或RON在乳腺癌患者中呈高表达状态[15-16]，从而导致乳腺癌的恶化。而体外实验表明，RON过表达会导致肿瘤细胞的迁移侵袭能力增强，抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞的增殖。而抑制RON的活性则会出现相反的结果。
　　但目前对于RON如何导致乳腺癌侵袭和转移的机制尚不清楚。而其剪切异构体表达的变化可能是导致乳腺癌发生及恶化的原因。RON的改变同时常常与选择性前-mRNA剪接、蛋白的截短以及选择性转录产生RON变异体生成相伴随[17]。在各种原发癌样本和肿瘤细胞系中，目前至少有9个RON变异体已被识别出来，包括RONΔ160、RONΔ165、RONΔ155、RONΔ170、RONE5/6in等。根据缺陷部位的不同，RON变异体可以分为组成型激活、致瘤性或无生物活性[18]。而在乳腺癌等肿瘤中，主要的以RON△155、RONΔ165，RONΔ160出现较高的表达[19]。其中RONΔ160的作用是诱导细胞的转化，通过各种因子刺激肿瘤发生，提高肿瘤的迁移侵袭能力。而RONΔ160的形成是由于RON的5号及6号外显子109个氨基酸的缺失形成的，使得其在细胞外的半胱氨酸残基失衡，从而导致自身二聚体的形成，引发持续激活[20-21]，从而诱导肿瘤细胞的内生长相关信号处于级联激活状态，导致肿瘤在体内的持续增长。同时研究表明，RONΔ160可以诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，肿瘤细胞发生上皮间质转化的过程中，细胞黏连相关蛋白如E-钙粘蛋白等表达减少，而间质细胞相关蛋白表达量上升，细胞变成梭形后具有更强的迁移和侵袭能力。因此我们推测RON过表达导致的乳腺癌的转移及恶化可能与其剪切变异体RONΔ160的异常表达相关。
　　本研究首先用免疫组化的方法检测了RON在乳腺组织的表达，结果显示RON在正常组织中及癌旁和良性乳腺肿瘤中都表达量较低，而在乳腺癌组织中却异常高表达。同时，获取特异制备的RONΔ160抗体后，同样用免疫组化的方法对相关组织进行检测。发现RONΔ160在正常组织及癌旁组织中都不表达，在良性的乳腺肿瘤组织中有轻微表达，而在乳腺癌中却呈现高表达。同时用荧光定量以及Western blot来检测两者在不同乳腺组织中的表达，结果都和组化显示的结果一致，证明在乳腺癌中RON的高表达导致了RONΔ160的高表达，有可能是引起RON过表达所致乳腺癌的迁移和侵袭能力增强及恶化的原因。此后收集60例乳腺癌患者病灶及癌旁组织，通过Western blot实验结合临床记录发现RON和RONΔ160高表达的患者的临床分期以及组织学分级等级高，同时其高表达与淋巴结的转移的发生相关。且结果显示具有统计学差异。
　　综上所述，RON和RONΔ160在乳腺癌组织中相比正常组织高表达，并且其高表达导致了乳腺癌患者病情的恶化及淋巴转移。因此对RON和RONΔ160在乳腺癌患者的异常表达及对肿瘤的影响，使得其有可能成为肿瘤进行分子分型的标志。同时可以作为临床上判断肿瘤恶性程度及是否转移的标志。而对RON和RONΔ160表达与乳腺癌患者的耐药与预后的相关性还有待研究。同时，临床和基础上对RON和RONΔ160在细胞生物学上如何影响细胞信号转导来影响细胞的生物学行为将成为重要及必要的研究。
　　[参考文献]
　　[1] Wang MH，Wang D，Chen YQ. Oncogenic and invasive potentials of human macrophage stimulating protein receptor，the RON receptor tyrosine kinase[J]. Carcinogenesis，2003，23（8）：1291-1300.
　　[2] Zinser GM，Leonis MA，Toney K，et al.Mammary-specific Ron receptor overexpression induces highly metastatic mammary tumors associated with beta-catenin activation[J].Cancer Res，2006，66（24）：11967-11974. 　　[3] Lu Yi，Yao HP，Wang MH. Multiple variants of the RON receptor tyrosine kinase：Biochemical properties，tumorigenic activities， and potential drug targets[J]. Cancer Letters，2007，257（2）：157-164.
　　[4] Kretschmann KL，Eyob H，Buys SS，et al.The macrophage stimulating protein /Ron pathway as a potential therapeutic target to impede multiple mechanisms involved in breast cancer progression[J].Curr Drug Targets，2010，11（9）：1157-1168.
　　[5] Greenbaum A，Rajput A，Wan G.RON kinase isoforms demonstrate variable cell motility in normal cells[J].Heliyon，2016，2（9）：e00153
　　[6] Goldhirsch A，Wood WC，Coates AS，et al. Strategies for subtypes-dealing with the diversity of breast cancer：Highlights of the St.Gallen international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2011[J]. Ann Oncol，2011，22（8）：1736-1747.
　　[7] Robidoux A，Tang G，Rastogi P，et al. Lapatinib as a componen of neoadjuvant therapy for HER2-positive operable breast cancer（NSABP protocol B-41）：An open label，randomised phase 3 trial[J]. Lancet Oncol，2013， 14（12）：1183-1192.
　　[8] Venkitaraman AR. Cancer suppression by the chromosome custodians，BRCA1 and BRCA2[J].Science，2014， 343（6178）：1470-1475.
　　[9] 李挺.乳腺癌分子分型及臨床意义[J].中国实用外科杂志，2011，31（10）：952-954.
　　[10] Wang MH，Lee W，Luo YL，et al.Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in various epithelial cancers and its contribution to tumourigenic phenotypes in thyroid cancer cells[J].J Pathol，2007，213（4）：402-411.
　　[11] Sehrawat A，Singh SV.Short-form RON overexpression augments benzyl isothiocyanate-induced apoptosis in human breast cancer cells[J]. Mol Carcinog，2016，55（5）：473-485.
　　[12] 马琪，虞碧霞，陈俊丰，等.受体型酪氨酸激酶RON及其在恶性肿瘤发生发展中的作用研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2016，30（7）：784-789.
　　[13] Camp ER，Liu W，Fan F，et al. RON，a tyrosine kinase receptor involved in tumor progression and metastasis[J].Annals of Surgical Oncology，2015，12（4）：273-281.
　　[14] Thangasamy A，Rogge J，Ammanamanchi S.Regulation of RON tyrosine kinase-mediated invasion of breast cancer cells[J].J Biol Chem，2008，283（9）：5335-5343.
　　[15] Zabarovsky ER，Lerman MI，Minna JD，et al.Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and others cancers[J].Oncogene，2002， 21：6915-6935.
　　[16] Welm AL，Sneddon JB，Taylor C，et al. The macrophage stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（18）：7570-7575. 　　[17] Chakedis J，French R，Babicky M，et al. A novel protein isoform of the RON tyrosine kinas receptor transforms human pancreatic duct epithelial cells[J]. Oncogene，2016， 35（25）：3249-3259.
　　[18] Wang MH，Kurtz AL，Chen YQ.Identification of a novel splicing product of the RON receptor tyrosine kinase in human colorectal carcinoma cells[J]. Carcinogenesis，2000， 21：1507-1512.
　　[19] Zhou YQ，He C，Chen YQ，et al. Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in human colorectal adenocarcinomas：Generation of different splicing variants and their oncogenic potential[J]. Oncogene，2003， 22：186-197.
　　[20] Ronsin C，Muscatelli F，Mattei MG，et al. A novel putative receptor protein tyrosine kinase of the met family[J].Oncogene，1993，8：1195-1202.
　　[21] Zhang K，Zhou YQ，Yao HP，et al. Alterations in a defined extracellular region of the RON receptor tyrosine kinase promote RON-mediated motile and invasive phenotypes in epithelial cells[J]. Int J Oncol，2010;36：255-264.
　　（收稿日期：2019-07-09）
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