S100A14蛋白在巨块型宫颈鳞癌中的表达及其与化疗疗效的相关性研究

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　　[摘要] 目的 研究S100A14蛋白在宮颈鳞癌新辅助动脉化疗前后的改变及其与化疗疗效的相关性，以期在化疗前预测宫颈鳞癌对化疗药物的敏感性，使患者得到更加有效的个体化治疗。 方法 选取2014年10月～2017年3月在我院因ⅠB2及ⅡA2期宫颈鳞癌行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术或放疗的患者40例，所有患者术前均接受以顺铂为基础的联合化疗。另取因子宫肌瘤而行子宫全切术患者的正常宫颈上皮组织35例作为对照组。采用Western blot方法、免疫组化SP法检测组织中S100A14蛋白表达及定位。分析比较S100A14蛋白在正常宫颈上皮组织和巨块型宫颈鳞癌组织中的表达差异，比较其在化疗前后巨块型宫颈鳞癌组织中的表达差异，同时分析化疗前巨块型宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白表达与化疗疗效之间的关系。 结果 ①化疗1～2个周期后，40例宫颈鳞癌患者中，25例为化疗有效，15例为化疗无效，总有效率为62.5%。②S100A14蛋白在巨块型宫颈鳞癌组织中的表达明显高于正常宫颈上皮组织（P<0.01）。③S100A14蛋白在化疗后巨块型宫颈鳞癌组织中的表达显著高于化疗前（P<0.05）;化疗前巨块型宫颈癌组织中S100A14蛋白表达在化疗有效组中的表达低于化疗无效组（P<0.05）。结论 ①S100A14蛋白在宫颈鳞癌组织中高表达，在正常宫颈上皮组织中低表达。②早期巨块型宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白表达与新辅助动脉化疗的疗效相关。③化疗前宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白的表达情况有可能成为宫颈癌新辅助动脉化疗疗效的预测指标。
　　[关键词] S100A14;宫颈鳞癌;新辅助动脉化疗;顺铂;敏感性
　　[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）03-0025-05
　　[Abstract] Objective To study the changes of S100A14 protein before and after neoadjuvant chemotherapy in cervical squamous cell carcinoma and its correlation with chemotherapy efficacy， in order to predict the sensitivity of cervical squamous cell carcinoma to chemotherapy before chemotherapy， so that patients can gain more effectively individualized treatment. Methods 40 patients with neoadjuvant arterial chemotherapy and radical resection of cervical cancer or radiotherapy for ⅠB2 and ⅡA2 cervical squamous cell carcinoma at our hospital from October 2014 to March 2017 were selected. All patients received cisplatin-based combined chemotherapy before surgery. In addition， 35 cases of normal cervical epithelial tissue of patients with uterine fibroids who underwent uterine hysterectomy were used as control group. The expression and localization of S100A14 protein in tissues were detected by Western blot and immunohistochemical SP method. The differences in the expression of S100A14 protein in normal cervical epithelial tissues and massive cervical squamous cell carcinoma were analyzed and compared. The difference in expression of S100A14 protein in massive cervical squamous cell carcinoma before and after chemotherapy was compared. And the relationship between expression of S100A14 protein in massive cervical squamous cell carcinoma and chemotherapy efficacy was analyzed before chemotherapy. Results ①Of the 40 patients with cervical squamous cell carcinoma after 1 to 2 cycles of chemotherapy， 25 were effective in chemotherapy and 15 were ineffective in chemotherapy. The total effective rate was 62.5%. ②The expression of S100A14 protein in massive cervical squamous cell carcinoma was significantly higher than that in normal cervical epithelial tissue（P<0.01）. ③The expression of S100A14 protein in massive cervical squamous cell carcinoma after chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy（P<0.05）. The expression of S100A14 protein in massive cervical cancer tissues before chemotherapy was lower in the chemotherapy-effective group than that in the chemotherapy-ineffective group（P<0.05）. Conclusion ①S100A14 protein is highly expressed in cervical squamous cell carcinoma and low in normal cervical epithelial tissues. ②The expression of S100A14 protein in early massive cervical squamous cell carcinoma is associated with the efficacy of neoadjuvant arterial chemotherapy. ③The expression of S100A14 protein in cervical squamous cell carcinoma before chemotherapy may be a predictor of neoadjuvant chemotherapy for cervical cancer. 　　[Key words] S100A14; Cervical squamous cell carcinoma; Neoadjuvant arterial chemotherapy; Cisplatin; Sensitivity
　　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，位居女性恶性肿瘤第4位、人类恶性肿瘤第7位，在女性恶性肿瘤中的发病率及死亡率仅次于乳腺癌[1]。根据FIGO分期，目前针对临床分期处于ⅠB2及ⅡA2期的宫颈癌患者常推荐的治疗方案为在新辅助化疗（Neoadjuvant chemotherapy，NACT）后实行宫颈癌根治术+盆腔淋巴清扫术[2-4]。但新辅助动脉化疗的敏感性有很大的个体差异，如何在化疗前预测肿瘤对化疗药物的敏感性或耐药性，避免使用不敏感药物而增加化疗药物的毒副作用和多重耐药基因的表达，及时采用确切手术或放疗等治疗方法，具有显著临床意义。
　　S100A14是2002年由PietaS等通过比较基因组杂交在人类肺癌细胞系中发现的S100家族的新成员。最近有研究报道，S100A14蛋白在许多肿瘤中都存在差异性表达[5-7]。这提示在不同肿瘤的发生发展阶段S100A14扮演着不同的角色，S100A14可能通过多种作用机制和信号通路影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为[8]。国内有研究表明S100A14蛋白的过度表达与宫颈癌FIGO分期和淋巴转移显著相关，S100A14促进宫颈癌细胞的细胞周期进程、细胞生长、迁移和侵袭[9]。也有研究提示S100A14可能参与卵巢癌患者对以铂类为基础的化疗的耐受[10]。但S100A14蛋白的表达与宫颈癌新辅助动脉化疗及其疗效之间的关系尚未见报道。本研究应用Western blot方法、免疫组化SP法检测正常宫颈上皮组织、新辅助动脉化疗前后的宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白的表达及定位，分析其表达的差异性及与化疗疗效之间的相关性，从而寻找新辅助动脉化疗疗效的预测指标，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　选取2014年10月～2017年3月因巨块型宫颈鳞癌（肿瘤直径>4 cm，FIGO分期为ⅠB2及ⅡA2期）在我院就诊行新辅助动脉化疗后行宫颈癌根治术或放疗的患者40例，另选取因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈上皮组织标本患者35例，此前未接受任何特殊治疗。40例宫颈癌患者年龄25～62岁，平均（45±9）岁。35例子宫肌瘤患者年龄29～58岁，平均（41±7）岁。肿瘤分期由2名或2名以上从事妇科肿瘤的副主任及以上级别医师共同判定。根据FIGO 2009年宫颈癌临床分期，其中ⅠB2期23例（57.5%），ⅡA2期17例（42.5%）。所有病例临床资料完整，均经病理学诊断证实，排除同时合并其他部位恶性肿瘤和心血管系统疾病及糖尿病者。新辅助动脉化疗方案为：采用Seldinger技术，行双侧子宫动脉插管灌注化疗加栓塞术。化疗方案是以顺铂为基础的联合化疗：顺铂45 mg，博来霉素15 mg，单次灌注。根据化疗疗效分别给予1～2个周期的化疗。患者接受化疗前通过妇科检查及影像学检查测量病灶大小，动脉化疗结束2～3周后根据WHO实体瘤的近期疗效评定标准评估化疗疗效。化疗后宫颈局部癌灶完全缓解和部分缓解归入化疗有效组[25例，平均（46±8）岁]，稳定和进展归入化疗无效组[15例，平均（44±10）岁]。化疗有效组（CR+PR）行广泛全子宫切除加盆腔和（或）腹主动脉旁淋巴结清扫术，选择放疗的化疗无效组放疗前行宫颈活检术获得宫颈癌组织。本研究经本院伦理委员会批准，接受新辅助动脉化疗的患者均签署知情同意书。
　　1.2 方法
　　留取40例宫颈癌患者化疗前和手术切除的肿瘤边缘生长活跃宫颈癌标本及因子宫肌瘤行子宫全切术术中正常宫颈上皮组织的新鲜标本。切片行常规HE染色，染色片均经高级别专业病理医师复查，确定正常宫颈组织和巨块型宫颈癌组织的病理学类型、病理分级和癌组织成分。
　　提取总蛋白，利用一抗结合S100A14蛋白，WB检测化疗前后宫颈癌组织及正常宫颈上皮组织各指标的表达情况。S100A14 兔多克隆抗体试剂盒购自圣克鲁斯生物技术，滴度1∶500。SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。染色方法按试剂盒说明进行，石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，使用微波炉进行抗原热修复，修复液为pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液。经DAB染色、苏木精复染，中性树胶封闭。以PBS代替一抗作为阴性对照，以实验室前期研究证实的S100A14阳性的乳腺癌组织作为阳性对照。
　　1.3 评价指标
　　1.3.1 WB结果分析  对底片进行灰度扫描或拍照，利用Quantity One凝胶分析软件分析，以目的蛋白条带与内参条带累积光密度（IOD）之比作为反映蛋白表达水平的相对指标。分析光密度值，将结果导入Excel表中，计算目的蛋白与内参蛋白的光密度比值，每个样本与GAPDH内参重复测量3次取平均值，制成柱形图。
　　1.3.2 SP结果分析  SP法染色阳性结果判定：S100A14蛋白阳性染色表现为细胞浆和/或细胞膜呈棕黄色。随机计数10个高倍视野（×400），每个视野读取100个癌细胞计数阳性细胞数，计算阳性率，取平均值，分别进行阳性率及着色强度评分。阳性细胞计数：阳性细胞数百分比（%）=（视野阳性细胞数/视野总癌细胞数）×100%，≤5%为0分，6%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分;着色强度：深棕色为3分，浅棕色为2分，浅黄色为1分，无着色为0分;将阳性百分率和着色强度两项评分的乘积进行统计分析。分别由两位资深的病理学专家单独对免疫组织化学染色结果进行评定，并最终达成一致意見。
　　1.3.3 疗效评价  ①完全缓解（complete remission，CR）：肿瘤完全消失;②部分缓解（partial remission，PR）：肿瘤缩小50%以上;③稳定（stable disease，SD）：肿瘤减小<50%，或增大<25%;④进展（progressive disease，PD）：肿瘤增大>25%或有新的病灶出现。 　　1.4 统计学方法
　　采用SPSS19.0统计学软件进行分析，数据先进行shapiro wilk正态性检验，患者临床特征数据均为正态分布，采用均数±标准差（x±s）表示[11]，两样本均数比较采用独立样本t检验，四格表资料采用Fisher确切概率法，两组独立样本等级资料比较采用Wilcoxon两样本秩和检验。经免疫组化染色方法检测得到宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白化疗前后的统计数据为非正态分布，采用中位数（P25～P75）表示。由于每一例宫颈鳞癌患者化疗前后组织间呈配比关系，因此比较化疗前后宫颈鳞癌组织中相关蛋白质表达水平差异时，采用Wilcoxon配对秩和检验。化疗前各种蛋白质在有效组与无效组之间的比较，采用Mann-Whitney U法检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 宫颈鳞癌患者化疗疗效分析
　　化疗1～2个周期后，40例宫颈鳞癌患者中，CR12例（30.0%），PR13例（32.5%），SD11例（27.5%），PD4例（10.0%）。根据化疗疗效将全部患者分为化疗有效组（CR+PR）和化疗无效组（SD+PD），总有效率为62.5%。
　　2.2 宫颈鳞癌患者临床特征
　　40例宫颈鳞癌患者临床特征，采用独立样本t检验比较两组患者年龄、肿瘤大小，采用Fisher确切概率法比较两组患者临床分期，采用Wilcoxon两样本秩和检验比较两组患者病理分化程度（P均>0.05），两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性。见表1。
　　2.3 宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白表达
　　利用WB和免疫组化SP法检测正常宫颈上皮组织及巨块型宫颈鳞癌组织（N和C）、化疗前后巨块型宫颈鳞癌组织（Pre和Post）、化疗有效组和无效组巨块型宫颈鳞癌组织（R和NR）中S100A14的表达情况。选择5例进行WB实验是为了初步探索趋势，同时可节约经费，确认有趋势之后选择免疫组化进行大样本实验进一步明确，免疫组化不仅能够明确蛋白表达量高低，还可以明确蛋白定位，比WB更适合本实验。
　　2.3.1 正常宫颈上皮组织、各组巨块型宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白表达情况  结果发现S100A14蛋白在巨块型宫颈鳞癌组织中的表达明显高于在正常宫颈上皮组织中的表达，差异有统计学意义（P<0.01）;S100A14蛋白在化療后巨块型宫颈鳞癌组织中的表达高于化疗前癌组织中的表达，在化疗无效组化疗前巨块型宫颈鳞癌组织中的表达高于有效组化疗前癌组织中的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表2～4。
　　2.3.2 正常宫颈上皮组织、各组巨块型宫颈鳞癌组织中S100A14蛋白表达情况  SP结果显示S100A14蛋白在正常宫颈、巨块型鳞癌组织中均有表达，表达均主要位于细胞膜和细胞浆中，且细胞膜上的分布更典型，化疗前后S100A14蛋白的定位没有明显变化，细胞浆细胞膜内均会存在，化疗有效组及无效组S100A14蛋白在巨块型鳞癌细胞中的定位无明显差异，均定位在细胞浆或/和细胞膜中。见封三图1。
　　在35例正常宫颈组织中除11例正常宫颈上皮组织未见S100A14蛋白表达外，其余24例正常宫颈上皮组织及40例巨块型宫颈鳞癌组中均见S100A14蛋白表达，S100A14蛋白在巨块型宫颈鳞癌组织中特异性表达，明显高于正常宫颈上皮组织，差异有统计学意义（P<0.01），见表5。40例患者化疗前后的巨块型宫颈鳞癌细胞中，除3例化疗后未见宫颈癌组织，其余均可见S100A14蛋白的表达，S100A14蛋白在化疗后巨块型宫颈癌组织中表达强度比化疗前巨块型宫颈癌组织中高，差异有统计学意义（P<0.05），见表6。在25例化疗有效组、15例化疗无效组的患者化疗前巨块型宫颈鳞癌细胞中均见S100A14蛋白表达，且化疗无效组S100A14蛋白表达明显高于化疗有效组（免疫组化SP法，×400），经Mann-Whitney U法检验，化疗前巨块型宫颈癌组织中S100A14蛋白在化疗有效组中的表达强度均比化疗无效组中低，差异有统计学意义（P<0.05），见表7。
　　3 讨论
　　新辅助化疗是在宫颈癌手术或放疗前先进行化疗，使瘤体体积缩小，提高手术切除率或提高肿瘤细胞对放疗的敏感性。同时还具有消除可能存在的微转移灶，减少术中播撒，降低分期，改善宫旁浸润情况等优点[12]。近年来随着介入技术水平的提高和不断发展，辅助化疗在妇科恶性肿瘤中的应用日益普遍。然而辅助动脉化疗存在许多不足之处，由于肿瘤负荷过重及化疗可能诱导肿瘤细胞产生耐药性等原因，部分宫颈癌患者对辅助动脉化疗无反应[13]。因此，寻找能预测宫颈癌对以顺铂为基础的新辅助动脉化疗疗效的指标至关重要。本研究通过检测S100A14蛋白在宫颈癌新辅助动脉化疗前后表达状态及水平的变化，判断其在宫颈癌新辅助动脉化疗疗效预测中的作用。
　　S100A14属于钙结合蛋白家族的一个较新成员。S100A14具有S100家族典型的结构特征，其表达受p53的调控[14]。S100A14蛋白在各种癌中的表达情况并不一致，例如在肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌中高表达，而在肾癌、结直肠癌和食管鳞状细胞癌中低表达[15]。正常组织中S100A14蛋白的表达情况也不一样，如正常食管上皮、结直肠上皮组织中高表达[6]，在肺、肝、肾的正常组织中中度表达，心脏中低表达，在脑、脾、外周血白细胞中没有表达[16]。而且S100A14蛋白在正常的肺、乳腺组织中主要分布于细胞胞浆，而在肿瘤组织中主要分布于细胞膜[17]。本研究发现S100A14蛋白在巨块型宫颈鳞状细胞癌组织中的表达较正常宫颈上皮组织表达强度明显增强。
　　国内外研究发现S100A14对细胞的增殖有双重作用，其调节细胞增殖侵袭迁移等癌症进展能力的差异可能反映不同组织或细胞类型的不同特征，在肝癌细胞中发现其可促进细胞增殖[18]，而在口腔癌和食管癌中其可通过诱导G1期阻滞而抑制细胞增殖[19，20]、促进细胞侵袭[21]。S100A14蛋白的过表达与胃癌、结肠直肠癌和小肠癌的预后相关[22]。S100A14蛋白低表达与高结直肠癌转移潜能相关[23]。S100A14蛋白被鉴定为能预测乳腺癌细胞的远处转移潜在新型标记物[24]。王翔宇等证明了S100A14的过度表达与宫颈癌FIGO分期和淋巴转移显著相关，其在宫颈癌细胞中诱导EMT，促进宫颈癌细胞的细胞周期进程、细胞生长、迁移和侵袭[9]。 　　綜上所述，S100A14参与恶性肿瘤的发生发展，S100A14或许能抑制宫颈癌顺铂耐药细胞的增值，作为宫颈癌对以顺铂为基础的新辅助动脉化疗疗效的预测指标。本研究发现巨块型宫颈鳞状细胞癌中S100A14蛋白较正常宫颈上皮组织高表达，在新辅助化疗后切除组织中较化疗前活检组织中的蛋白表达增加，并且高表达S100A14蛋白的患者新辅助化疗反应率较差。这些结果提示S100A14蛋白可能成为巨块型宫颈鳞状细胞癌采取新辅助化疗的潜在甄选指标。但是对于S100A14蛋白在宫颈鳞状细胞癌中的潜在通路作用机制还需要进一步采用基础细胞实验证实。
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　　（收稿日期：2019-06-05）
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