SF、25-OH Vit D及miR-122水平在NAFLD患者中表达及临床意义

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　　 【摘要】 目的：探討铁蛋白（SF）、25羟基维生素D（25-OH Vit D）及微小RNA-122（miR-122）水平在不同程度非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者中表达及临床意义，为NAFLD诊断及严重程度的判断提供科学依据。方法：选择2017年11月-2019年5月来医院就诊并确诊为NAFLD患者270例为NAFLD组，同期健康人群120例为HC组，分别检测血清中SF、25-OH Vit D及miR-122水平。结果：NAFLD组患者SF和miR-122水平明显高于HC组，差异有统计学意义（P<0.05），而25-OH Vit D水平明显低于HC组，差异有统计学意义（P<0.05）;NAFLD男性患者SF和25-OH Vit D水平明显高于女性患者，差异有统计学意义（P<0.05），而miR-122水平差异无统计学意义（P>0.05）;NAFLD患者SF和miR-122水平随着NAFLD患者病情的加重而呈上升趋势，不同程度患者之间差异有统计学意义（P<0.05），而25-OH Vit D水平呈下降趋势，不同程度患者之间差异有统计学意义（P<0.05）;NAFLD患者血清中SF和miR-122水平与NAFLD病情严重程度呈正相关（r=0.592、0.639，P<0.05），而25-OH Vit D水平与NAFLD病情严重程度呈负相关（r=-0.617，P<0.05）。结论：NAFLD患者SF和miR-122水平明显升高，且与病情严重程度呈正相关，而25-OH Vit D水平明显下降，与病情严重程度呈负相关。因此，SF、25-OH Vit D及miR-122水平检测对NAFLD诊断及严重程度的鉴别诊断具有重要的意义，值得临床推广应用。
　　 【关键词】 非酒精性脂肪肝 铁蛋白 25羟基维生素D 微小RNA-122 表达
　　 [Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical significance of ferritin （SF）， 25 hydroxyl vitamin D [25-OH Vit D] and miR-122 in patients with different degrees of nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， so as to provide scientific basis for the diagnosis and severity of NAFLD. Method： From November 2017 to May 2019， 270 patients diagnosed with NAFLD were selected as NAFLD group and 120 healthy patients were selected as HC group. The serum levels of SF， 25-OH Vit D and miR-122 were detected respectively. Result： SF and miR-122 levels in NAFLD group were significantly higher than those in HC group， the difference was statistically significant （P<0.05）， while the level of 25-OH Vit D were significantly lower than those in HC group， the difference was statistically significant （P<0.05）. SF and 25-OH Vit D levels in male NAFLD patients were significantly higher than those in female NAFLD patients， the difference was statistically significant （P<0.05）， but there was no significant difference between two groups in the level of miR-122 （P>0.05）. The levels of SF and miR-122 in NAFLD patients increased with the aggravation of NAFLD patients’ condition， with statistically significant differences among patients of different degrees （P<0.05）， while the level of 25-OH Vit D decreased， with statistically significant differences among patients of different degrees （P<0.05）. The levels of SF and miR-122 in NAFLD patients were positively correlated with the severity of NAFLD （r=0.592， 0.639， P<0.05）， while the level of 25-OH Vit D were negatively correlated with the severity of NAFLD （r=-0.617， P<0.05）. Conclusion： The levels of SF and miR-122 in NAFLD patients are significantly increased and positively correlated with the severity of the disease， while the level of 25-OH Vit D is significantly decreased and negatively correlated with the severity of the disease. Therefore， the detection of SF， 25-OH Vit D and miR-122 levels are of great significance for the differential diagnosis of NAFLD diagnosis and severity， and worthy of clinical application. 　　 非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是一种非酒精因素引起的以肝细胞内脂肪过度沉积为典型特征的肝病，是我国最常见的一种慢性肝病，约1/3的NAFLD患者将演变为脂肪性肝炎、肝硬化、肝衰竭甚至肝癌，应引起社会高度重视[1-2]。NAFLD发病机制十分复杂，研究表明，NAFLD的发生和发展与遗传、环境、代谢、胰岛素抵抗及应激相关因素等诸多因素有关[3-4]。铁是人体代谢必需的微量元素，但过多的铁能通过调节自由基的释放而对人体组织和器官造成损伤，继而导致多种脏器病变，SF是人体内铁的主要贮存形式，当铁摄入增加时，SF亦增加，是反映体内铁负荷过多的有效指标[3]。25-OH Vit D主要生物作用是调节人体钙磷代谢，但近年来研究发现，维生素D还具有保护人体心血管、调节人体免疫能力及减轻胰岛素抵抗等诸多作用[5-6]。miR-122是最早发现的具有组织特异性的一种miRNAs，在肝脏组织中呈高度表达，有研究表明，miR-122在肝脏的生理功能和疾病发生方面发挥着重要的作用[7-8]。为此，本研究对SF、25-OH Vit D及miR-122水平在不同程度NAFLD患者和健康人群中表达及临床意义进行了调查分析，探讨其在NAFLD发生和发展中变化情况及临床意义，为NAFLD早诊断、早治疗及早预防提供科学依据，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　 选择2017年11月-2019年5月来医院就诊并确诊为NAFLD患者270例，其中男183例，女87例，年龄23～65岁，平均（37.52±11.47）岁。（1）纳入标准：符合2010年中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学编著的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[9]。（2）NAFLD病情严重程度判断标准：根据肝脏多普勒彩色超声结果来判断[2，6]：①肝区近场回声弥漫性增强（强于肾脏与脾脏），远场回声逐渐衰减;②肝内管道结构显示不清;③肝臟轻至中度肿大，边缘角圆钝;④肝内彩色血流信号减少或不易显示，但肝内血管走向正常;⑤肝右叶包膜及横幅回声显示不清或不完整。具备①项和②～④项中任何一项者为轻度脂肪肝，具备①项和②～④项中任何两项者为中度脂肪肝，具备①项和②～④项中任何两项及⑤项者为重度脂肪肝，其中轻度、中度和重度脂肪肝分别为125、96和49例。同时选择同期健康人群120例为对照组，其中男82例，女38例，年龄22～68岁，平均（38.65±12.53）岁。（3）排除标准：高血压、高血脂、糖尿病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、药物性肝炎、肝硬化、肾功能不全、心脑血管疾病、肝功能异常及有饮酒嗜好，长期每日饮酒量折合乙醇量男性>80 g、女性>40 g者。两组患者的一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经同医院伦理委员会同意批准，并经同患者及家属知情同意，签订知情同意书。
　　1.2 仪器与试剂
　　 BS800全自动生化分析仪、试剂、校准品及质控物均由mindray公司提供;IS 1200全自动化学发光分析仪、试剂、校准品及质控物由四川迈克公司提供;ABI step one plus荧光PCR分析仪由美国ABI公司提供;miRNA提取、miRNA逆转录及实时荧光定量PCR试剂盒均由德国Qiagen公司提供。
　　1.3 方法
　　1.3.1 标本采集 研究对象于清晨空腹采用一次性采血针采集静脉血于2支无抗凝剂的干燥管内，每管4～5 ml，均于室温静置30 min后于离心机内离心，其中一管用作SF和25-OH Vit D检测，另外一管取上清液移至Eppendorf管中，于-70 ℃冰箱内冷藏备用，用于miR-122检测。
　　1.3.2 SF和25-OH Vit D检测 SF检测采用BS800全自动生化分析仪免疫比浊法，25-OH Vit D采用IS 1200全自动化学发光分析仪进行检测，检测前对相应分析仪进行保养、校准及室内质控检测，待室内质控结果在控后再进行研究标本检测，确保检测结果的准确性。所有操作均严格按照仪器和试剂说明书及科室内SOP操作规程进行。
　　1.3.3 RNA提取 采用吸附柱法提取RNA，所有操作均严格按照miReasy Mini Kit的操作手册进行。具体操作：取低温冷藏的血清标本400 ?l，加入2 000 ?l的QIAzol试剂中，于冰上融化后充分混匀，置室温5 min，然后于离心机内离心15 min（12 000 g），取上层水相300 ?l转移至新的离心管中，取加入450 ?l的100%乙醇，充分混匀，最后取30 ?l的RNease-free water溶解RNA，置于-80 ℃低温冰箱内保存。
　　1.3.4 miR-122检测 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清中miR-122的表达，取RNA样本15 μl，4 μl Buffer RT和1 μl Mix，使用miScript Reverse Transcription Kit试剂盒于PCR仪上进行miRNA的逆转录cDNA。（1）反应体系为：RNA模板2 μl，特异引物2 μl，SYBR缓冲液10 μl及无RNA酶的灭菌水4 μl。（2）扩增条件：95 ℃预变性10 min，然后以95 ℃
　　10 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 15 s循环45～70次，最后进行熔解曲线分析，所有操作均严格按照miRNA qRT-PCR检测系统进行。（3）miR-122相对水平计算：采用2-ΔΔCT法计算浓度相对水平（Re），计算公式为ΔCTc=CTc目-CTc内，ΔCTn=CTn目-CTn内（c为NAFLD组，n为HC组）。
　　1.4 统计学处理
　　 采用GraphPad Prism 5.0统计软件对所测数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，多组间比较采用F检验，相关性采用Spearman分析，P<0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果
　　2.1 两组SF、25-OH Vit D及miR-122比较
　　 NAFLD组患者SF和miR-122水平明显高于HC组，差异有统计学意义（P<0.05），而25-OH Vit D水平明显低于HC组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2 不同性别NAFLD患者SF、25-OH Vit D及miR-122比较
　　 NAFLD男性患者SF和25-OH Vit D水平明显高于女性患者，差异有统计学意义（P<0.05），而miR-122水平之间差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
　　2.3 不同程度NAFLD患者SF、25-OH Vit D及miR-122比较
　　 NAFLD患者SF和miR-122水平随着NAFLD患者病情的加重而呈上升趋势，不同程度患者之间差异有统计学意义（P<0.05），而25-OH Vit D水平呈下降趋势，不同程度患者之间差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
　　2.4 相关性分析
　　 经Spearman相关性分析，结果显示NAFLD患者血清中SF和miR-122水平与NAFLD病情严重程度呈正相关（r=0.592、0.639，P<0.05），表明SF和miR-122水平随着NAFLD病情的加重而逐渐升高，而25-OH Vit D水平随着NAFLD病情的加重而呈逐渐下降，与NAFLD病情严重程度呈负相关（r=-0.617，P<0.05）。
　　3 讨论
　　 NAFLD是西方国家最常见的一种肝脏疾病，成人发病率高达30%左右，我国发病率较低，但最近几年随着人们生活水平不断提高及饮食结构的改变，NAFLD发病率呈逐渐上升趋势，其发病率已位于所有肝病的第2位，且发病年龄逐渐年青化。NAFLD是一种可逆性肝病，若不能及时诊断、治疗及控制，可继发脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌等一系列并发症，严重影响患者的生活质量，增加患者家庭及社会负担[10-11]。NAFLD发病病因十分复杂，发病机制目前尚未完全明确，且早期临床症状不典型，易被患者忽视，错过及早发现和及早预防的良机。临床诊断金标准是肝穿刺活检，但创伤性强，且不利于病情随访及疗效的判断。因此，寻找特异性生化指标，对NAFLD早期诊断、病情评估、疗效判断及干预性预防并给予规范治疗，对改善患者肝功能、控制病情进一步发展具有重要意义。
　　 SF是人体内铁的主要贮存形式，其水平随着人体铁摄入量的增加而增加，是反映体内铁负荷过多的有效指标。铁是人体内代谢必需的一种微量元素，肝脏是人体内铁代谢的主要器官，但过负荷的铁会在肝脏内堆积，铁作为氧化剂激活氧化应激反应，促进自由基生成，引起肝细胞器的损伤和肝细胞死亡，导致肝损伤[3-4]。有关研究发现，多种肝脏疾病都存在铁代谢紊乱的现象，过多铁的沉积会加重肝纤维化和肝硬化的进程。最近几年有研究证实，大多数NAFLD患者的肝脏组织存在铁过多，且铁在肝脏的沉积与临床症状恶化以及肝相关疾病病死率密切相关[3-4，12]。本研究结果显示，NAFLD患者血清中SF水平明显高于健康人群，差异有统计学意义（P<0.05），与马会民等[12]报导的结论基本一致，且SF水平随着NAFLD病情的加重而呈上升趋势，与NAFLD病情严重程度呈正相关（r=0.592），表明了SF在NAFLD的发生和发展中发挥了重要作用。
　　 NAFLD主要是三酰甘油在肝细胞内沉积而引起代谢紊乱综合征和胰岛素抗抵症，有研究表明，其发病机制可能与胰岛素抵抗和慢性轻度炎症有关。维生素D进入人体经羟化后形成具有活性的1，25-（OH）2D3，与维生素D受体结合，然后与维甲酸受体结合为复合物，调节胰岛素受体表达和胰岛素对葡萄糖转运敏感染性，减少胰岛素抵抗。同时，维生素D可有效抑制轻度炎症反应，减少炎症反应因子的产生。有关文献表明，25-OH Vit D低水平对存在严重的胰岛素抵抗及轻度炎症的患者极易导致NAFLD的发生[13-14]。本研究结果显示，NAFLD患者血清中25-OH Vit D水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与有关文献报导的结论基本一致[5，13-14]，且其水平随着NAFLD病情的加重而呈逐步下降趋势，与NAFLD病情严重程度呈负相关（r=-0.617），这可能与25-OH Vit D低水平导致其减少胰島素抵抗和炎症反应因子产生的能力下降有关。
　　 microRNAs（miRNAs）是最近新发现的一种转录后调控基因的内源性非编码的小RNA分子，长约18～25个核苷酸。miRNAs通过转录后对基因水平的调控，参与机体的生理及病理过程，与多种疾病的发生和发展有关[15-16]。miR-122是miRNAs家族成员之一，是最早发现的一种miRNAs，具有组织特异性，在肝组织内呈高度表达，约占肝组织miRNAs的70%。有研究表明，miR-122是人体内在糖和脂质代谢过程中发挥重要作用的一种重要因子，具有促进胆固醇和脂肪酸合成，抑制胆汁酸和脂肪酸氧化等作用，在肝脏脂质代谢调控中发挥广泛的作用。最近有研究发现，miR-122表达水平的改变参与了调控HCV、HBV感染、非酒精性脂肪性肝病及肝脏肿瘤的发生和发展[17-18]。本研究结果显示，NAFLD患者血清中miR-122水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与Salvoza等[10]报导的和肖琳等[8]报导的一致，且miR-122水平随着NAFLD患者病情的加重而呈逐步上升趋势，与病情严重程度呈正相关（r=0.639），表明miR-122可能在NAFLD的发生和发展中发挥了重要的作用。
　　 本研究结果显示，男性NAFLD患者血清中SF和25-OH Vit D水平均高于女性患者，差异有统计学意义（P<0.05），这主要可能与男、女生理结构差异有关。女性血清中SF水平低于男性可能与女性周期性生理月经，慢性失血而影响体内铁摄入量，甚至造成体内缺铁有关，25-OH Vit D水平低于男性除了可能与女性怀孕期间所需摄入量增加而补充不足有关外，还可能与女性从事户外活动少，阳光照射时间短有关[19-20]。而不同性别NAFLD患者血清中miR-122水平之间差异无统计学意义（P>0.05），这可能与miR-122主要存在肝脏组织中，而不同性别人群肝脏组织不存在差异性有关，具体原因有待进一步研究。 　　 综上所述，NAFLD患者血清中SF和miR-122水平明显升高，且随病情的加重而呈上升趋势，与病情严重程度呈正相关，而25-OH Vit D水平明显降低，且随病情的加重而呈下降趋势，与病情严重程度呈负相关。同时，男性NAFLD患者血清中SF和25-OH Vit D水平明显高于女性，而不同性别之间miR-122水平无差异。因此，SF、miR-122及25-OH Vit D水平测定，对不同程度NAFLD患者的诊断及严重程度的鉴别诊断具有重要的意义，值得临床推广应用。
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　　（收稿日期：2019-11-04） （本文编辑：张亮亮）
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