逆相蒸发法结合响应面优化抗耐药结核菌药物利奈唑胺脂质体处方工艺研究

来源:用户上传      作者:佟雷 刘金丽 刘世娟

　　[摘要] 目的 通过逆相蒸发法制备抗结核药物利奈唑胺脂质体，并利用响应面法优化其制备工艺和处方组成。 方法 以包封率为主要指标进行单因素试验，以Box-Behnken响应面分析法优化其制备工艺。并将最优工艺下制得的利奈唑胺脂质体于倒置荧光显微镜下观察其形态。 结果 通过逆相蒸发法制备利奈唑胺脂质体的包封率较高;最佳制备工艺：胆固醇-卵磷脂质量比为1：2.45，缓冲液pH值为6.65，超声时间为3.2 min，旋转蒸发仪转速为50 r。 结论 逆相蒸发法的制备工艺简单，重现性好，所得包封率高。
　　[关键词] 利奈唑胺脂质体;逆相蒸发法;包封率;Box-Behnken响应面分析法
　　[Abstract] Objective To prepare antituberculous drug linezolid liposome using the reverse-phase evaporation method， and optimize its preparation process and prescription composition using the response surface method. Methods Single-factor experiment was performed with the entrapment rate as key indicators， and Box-Behnken response surface analysis was used to optimize the preparation process. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results It was found that the entrapment rate of linezolid liposome prepared using the reverse-phase evaporation method was relatively high; under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：2.45， the pH value of the buffer solution was 6.65， the ultrasonic time was 3.2 min， and the rotation speed of the rotary evaporator was 50 r. Conclusion The reverse-phase evaporation method has the advantages of simple preparation process， good reproducibility and high entrapment rate.
　　[Key words] Linezolid liposome; Reverse-phase evaporation method; Entrapment rate; Box-Behnken response surface analysis
　　結核病是危害性较高的一种疾病，随着药学的快速发展，多种抗结核药物不断被研发且在临床上得到广泛应用。但抗结核药物往往会产生毒副作用，因此如何减轻抗结核药物的毒副作用成了新的研究热点。利奈唑胺为人工合成的恶唑烷酮类抗菌药，可抗多重耐药，利奈唑胺为水溶性药物，通常为片剂，患者口服后常会产生腹泻、呕吐等不良反应，其被吸收入血后不易到达病灶而且血药浓度超过一定浓度还会产生严重的毒副作用，因此如何将其有效成分安全高效地送至靶器官是一个极有意义的研究方向。脂质体的靶向性、两亲性、缓释性等特性使其成为一种理想的药物载体，因此本实验欲通过制备利奈唑胺脂质体来实现利奈唑胺的肺部直接给药[1-3]。
　　1 材料与仪器
　　紫外分光光度计（UV-6000PC），郑州宝京科技有限公司;旋转蒸发仪（QA-205B），济宁瑞德仪器设备有限公司;LS13320型激光粒度分析仪（江苏荣华仪器制造有限公司）;倒置荧光显微镜（U-LH100HG），OLYMPUS CORPORATION;利奈唑胺原料药（P09572），上海泰坦科技有限公司;卵磷脂（20180122），陕西澄明科技有限公司;胆固醇（20180228），江苏百得科技有限公司;磷脂膜荧光剂（20190310），SIGMAALDRICH。
　　2 方法与结果
　　2.1 最大吸收波长的选择
　　50 mL容量瓶中加入1 mg利奈唑胺，以 pH值为6.5的缓冲液定容，得20 μg/mL药物溶液，紫外分光光度法在200～400 nm范围内每隔10 nm测定吸光度，考察最大吸收波长并绘制曲线。移取空白脂质体混悬液2 mL至50 mL容量瓶中，同法测定。最终确定利奈唑胺最大吸收波长为289 nm，空白脂质体在此波长处无干扰。见图1、2。
　　2.2 利奈唑胺的含量测定
　　标准曲线的建立及方法学考察：10 mg利奈唑胺置50mL容量瓶中定容，得溶液浓度为200 μg/mL。移取0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL置25 mL容量瓶中定容，以PBS溶液为空白对照，得到标准曲线A=0.01C+0.0516，R2=0.9998。线性范围为1～24 μg/mL，考察其精密度RSD为0.32%，平均回收率为99.7%，24 h内稳定性0.15%，均低于2%，符合制备要求。 　　2.3包封率的测定
　　（1）游离药物量的测定：取利奈唑胺脂质体混悬液置于离心管中，2500 r/min离心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，缓冲液定容，测定吸光度，然后计算游离药物浓度。
　　（2）总药量的测定：取等量的利奈唑胺脂质体加入甲醇破乳，充分振摇后于2500 r/min下离心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩冲液定容，测定吸光度，然后计算总的药物浓度[4-5]。
　　（3）计算包封率的公式：包封率=（C总-C游离）/C总×100%。
　　2.4 逆相蒸发法制备利奈唑胺脂质体
　　精密称取卵磷脂100 mg和胆固醇50 mg于50 mL烧杯中，加入二氯甲烷5 mL、95%乙醇5 mL、吐温80 0.2 mL，在50℃恒温水浴锅上充分振摇使其完全溶解;10 mg利奈唑胺置50 mL烧杯中，加缓冲液5 mL使溶解;将两溶液混合后超声3～5 min，再于40℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂并形成均匀薄膜，加入40 mL 缓冲液，使膜溶解即得利奈唑胺脂质体[6-13]。
　　2.5 利奈唑胺脂质体制备处方工艺的单因素考察及结果[14]
　　在固定其他因素不变的前提下，分别对卵磷脂-胆固醇质量比、缓冲液pH、超声时间、旋转蒸发仪转速四个关键制备条件进行单因素考察，选取包封率最大的因素作进一步优化，其结果显示胆卵比（A）、缓冲液pH（B）、超声时间（C）为对包封率影响较大因素，见图3。
　　2.6 响应面法筛选最佳处方组成[15]
　　以单因素考察结果上下浮动设置三个梯度，通过Design Expert 8.0.6数据处理软件设计出的17组实验设计如表1所示，其中以利奈唑胺脂质体的包封率（Y）为响应值，其实验结果如表1所示。
　　2.6.1 显著性实验结果  根据2.6项中的实验数据，得到了关于利奈唑胺脂质体包封率（Y）和3个试验因素的回归方程为：Y=78.79+3.72A+1.84B+0.75C+1.80AB-0.12AC+1.01BC-8.81A2-11.42B2-9.03C2。方程中各项系数的绝对值大小反映各因素对响应值的影响程度，各项系数的正负反映各因素的影响方向，在本回归方程中，三个一次项系数值：A>B>C，故各因素的影响顺序为胆卵比>缓冲液pH>超声时间。
　　应用SPSS19.0软件对因变量与自变量进行多重线性回归分析，结果显示模型的显著水平P<0.0001，表明模型的显著性高;其中失拟项>0.05，不显著，说明模型与得到的实验值的差异小;而且R2=0.9684，R2Adj=0.9942，两者数值较为接近，说明本次实验的真实值和预测值相差较小，故可以应用本方程优化利奈唑胺脂质体的处方组成。见表2。
　　2.6.2响应曲面分析结果  在软件中绘制相应的响应面和等高线图，以此分析三个单因素两两之间的交互作用。两个因素间相互作用程度的强弱皆可以通过响应面的形状及等高线的特征来反映。
　　由图4可知，等高线呈椭圆形，说明A、B两因素交互作用明显，响应曲面较为陡峭，跨度较大，说明利奈唑胺脂质体的包封率受这两个因素交互作用的影响较大。等高线与胆固醇-卵磷脂质量比的轴线相交更为密集，表明胆固醇-卵磷脂质量比对利奈唑胺脂质体包封率的影响更大。
　　在图5中，等高线图为椭圆形，表明两因素交互作用明显，而且响应曲面比较陡峭，表明利奈唑胺脂质体包封率受这两个因素交互作用的影响。等高线与胆固醇-卵磷脂质量比的轴线相交更密集，说明利奈唑胺脂质体的包封率受胆固醇-卵磷脂质量比的影响更大。
　　由图6可知，等高线的图形为椭圆形，说明被考察因素之间交互作用明显，由于等高线与缓冲液pH的轴线相交更为密集，说明缓冲液pH对利奈唑胺脂质体包封率的影响较大。
　　最终系统给出最佳的处方组成为：胆固醇-卵磷脂质量比为1：2.45，其中胆固醇为50 mg，卵磷脂为122.5 mg，PBS缓冲液的pH值为6.65，超声时间为3.2 min，旋转蒸发仪转速为50 r。
　　2.7 验证试验结果
　　以上述最佳处方组成及制备工艺制备三批平行样本测定结果如表3所示，三批脂质体的平均包封率为78.19%，且RSD值小于2%，说明采用逆相蒸发法制备脂质体的可行度较高。
　　2.8 脂质体的形态观察结果
　　为观察载药脂质体形貌，对载药脂质体进行荧光染色（图7），使用NBD-PE荧光染色剂染色后的利奈唑胺脂质体呈现出黄绿色，如图8。在倒置荧光显微镜可以观察到利奈唑胺脂质体的外观为椭球形且较为圆整如封三图8，平均粒径范围（610±26）nm，如图9所示。
　　3 讨论
　　3.1 脂质体作为药物载体的缺点
　　脂质体膜为磷脂双分子层结构，其膜具有流动性，造成被包封药物易于泄露，导致脂质体载药量下降，在混悬液pH值发生改变或温度发生变化的特殊条件下，脂质体容易产生聚集、融合现象，由于脂质体的组成为磷脂类物质，易发生氧化，因此在实际生产制备脂质体的过程中应加入适量抗氧化剂，保证脂质体的稳定性。
　　3.2 胆固醇在脂质体制备过程中的应用
　　在制备脂质体的过程中，胆固醇作为构成脂质体膜的重要组成，对于膜的流动性起到重要的调节作用，因此加入胆固醇有利于提高脂质体膜的稳定性，降低药物的泄露率。
　　3.3 Box-Behnken响应面分析法的优势
　　Box-Behnken响应面分析法是较为科学的分析方法，其通过对实验结果进行科学的数学建模并对实验数据进行精确的统计分析，从而得出最佳方案，Box-Behnken 效应面法可连续对试验各水平进行分析，在反映各因素不同程度对制备工艺影响的同时，还直观体现了因素间的交互作用，相对均匀设计与正交设计试验具有实验精度高、预测性好的优势。 　　[参考文献]
　　[1] 张朝辉，严晶晶.我国结核病现状及其防治措施[J].海南医学，2018，29（23）：3386-3389.
　　[2] 孙小璐，张天华，刘凯.药物临床研究与应用利奈唑胺治疗耐药性肺结核病的临床疗效及安全性分析[J]. 中国医药导刊，2016，18（8）：800-801.
　　[3] 李佳，罗慧敏，范玉华，等.老年患者使用利奈唑胺的临床评价及不良反应监测[J].中国新药杂志，2017，26（11）：1322-1327.
　　[4] 吕晓燕，尹君婧，杨秀成，等.用于治疗非小细胞肺癌的阿法替尼脂质体的制备与包封率的测定[J].中国肺癌杂志，2018，21（9）：663-669.
　　[5] 王凤玉，张保献，张广平，等.盐酸常山碱的理化性质及其脂质体包封率的测定方法考察[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（1）：177-182.
　　[6] 祝侠丽，王莎莎，李玲华，等.基于近红外光响应性的盐酸阿霉素纳米脂质体的制备工艺优化[J].中国药房，2019， 30（10）：1312-1315.
　　[7] Wang Hongwu，Cui Huantian，Lin Lan，et al.The effects of a hirudin/liposome complex on a diabetic nephropathy rat model[J].BMC Complementary and Alternative Medi-cine，2019，19（1）：118.
　　[8] 侯丽芬，谷克仁，吴永辉.不同制劑脂质体制备方法的研究进展[J].河南工业大学学报（自然科学版），2016， 37（5）：118-124.
　　[9] 扈瑞瑞，申国明，高林，等.烟草绿原酸纳米脂质体的制备工艺及其稳定性研究[J].中国农业科技导报，2017， 19（4）：128-137.
　　[10] 华雪莲，张树彪，肖义，等.新型阳离子脂质体制备及应用研究[J].化学研究与应用，2019，31（2）：177-183.
　　[11] Sun Zhongqi，Deng Yun，Zhao Yanyun.Preparation，Optimization，and Characterization of Natural Apple Essence-Loaded Liposomes[J].Journal of Food Science，2019.
　　[12] Yamamoto E，Miyazaki S，Aoyama C，et al.A simple and rapid measurement method of encapsulation efficiency of doxorubicin loaded liposomes by direct injection of the liposomal suspension to liquid chromatography[J].Int J Pharm，2018，536（1）：21-28.
　　[13] Sheng ZJ，Xu WP，Xu TJ，et al.New developments in liposomal drug delivery systems[J].China Pharmaceuticals，2015，24（23）：6-9.
　　[14] 马宁辉，路璐，丁越，等.盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共载脂质体的制备及包封率的测定[J].中草药，2019，50（1）：69-75.
　　[15] 高艳，郑梦成，杜守颖，等.桂皮醛脂质体制备工艺研究[J].天津中医药大学学报，2019，38（2）：180-185.
　　（收稿日期：2019-08-30）
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