miR-1与miR-499调控心肌细胞增殖与凋亡机制研究

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　　【摘要】 目的 探究微小RNA（miR）-1与miR-499在心肌细胞增殖与凋亡过程中的调控作用及其机制。方法 选取大鼠H9C2心肌细胞株， 培养DMEM培养基， 将培养好的H9C2心肌细胞分为空白对照组、阴性对照组（采用随机合成的miRNA片段通过脂质体2000转染试剂进行转染）、miR-1 inhibitor组（采用随机合成的miR-1 inhibitor片段通过脂质体2000转染试剂进行转染）、miR-499 mimics组（采用随机合成的miR-499 mimics片段通过脂质体2000转染试剂进行转染）。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染情况， 设置空白对照组、H2O2组（未进行转染的H9C2心肌细胞）、干预组A（miR-1 inhibitor转染的H9C2心肌细胞）、干预组B（miR-499 mimics转染的H9C2心肌细胞）、干预组C（miR-1 inhibitor+miR-499 mimics转染的H9C2心肌细胞）。通过H2O2诱导建立H9C2心肌细胞氧化应激模型。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖情况， 流式细胞仪检测细胞凋亡情况， Western Blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、特异性半胱氨酸酶3（Caspase-3）蛋白表达水平。结果 miR-1 inhibitor组的心肌细胞miR-1表达明显低于空白对照组和阴性对照组， miR-499 mimics组心肌细胞miR-499表达明显高于空白对照组和阴性对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。空白对照组与阴性对照组的miR-1与miR-499表达比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组的（0.47±0.23）OD比较， H2O2组心肌细胞增殖（0.12±0.09）OD显著降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）;与H2O2组比较， 干预组A心肌细胞增殖（0.27±0.12）OD和干预组B心肌细胞增殖（0.29±0.13）OD均明显升高， 干预组C心肌细胞增殖（0.36±0.17）OD进一步升高， 但仍低于空白对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组比较， H2O2组细胞凋亡率显著升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）;对比H2O2组， 干预组A、干预组B细胞凋亡率均明显降低， 干预组C细胞凋亡率进一步降低， 但仍高于空白对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组比较， H2O2组心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平明显降低， 而Caspase-3蛋白表达水平明显升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）;与H2O2组比较， 干预组A和干预组B的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低， 但仍低于空白对照组， 而干预组C的Bcl-2蛋白表达水平进一步升高、Caspase-3蛋白表达水平进一步降低， 但仍高于空白对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 miR-1与miR-499在心肌细胞增殖与凋亡过程中发挥重要的调控作用， miR-1可能通过下调Bcl-2、上调Caspase-3蛋白表达促进心肌细胞凋亡， 而miR-499则通过上调Bcl-2、下调Caspase-3蛋白表达抑制心肌细胞凋亡， 针对这两个环节进行干预有望成为将来临床治疗心脏疾病的新途径。
　　【关键词】 微小RNA-1;微小RNA-499;心肌细胞;细胞增殖;细胞凋亡
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.12.086
　　心肌细胞凋亡在心力衰竭、心脏重构中扮演着重要角色， 减少心肌细胞凋亡可改善心脏重构， 改善心功能[1]。近年研究发现， 微小RNA（microRNA， miRNA， miR）在胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡、代谢、肿瘤发生等过程中发挥重要作用[2]。其中， miR-1、miR-499与心脏疾病的关系极为密切。本研究将miR-1 inhibitor、miR-499 mimics转染至H2O2处理的心肌细胞， 探究miR-1与miR-499在心肌细胞增殖与凋亡过程中的调控作用及其机制。现报告如下。
　　1 材料与方法
　　1. 1 实验材料 大鼠H9C2心肌细胞株， 购自中科院上海细胞库;胎牛血清、DMEM培养基、0.05%胰酶/EDTA（美国Hycloneo公司）;miR-1 inhibitor、竞争性短核糖核苷酸阴性对照序列（scramble-NC）、miR-499、miR-1和U6引物序列（上海吉凱基因化学技术有限公司）;miR-499 mimics（广州锐博公司）;H2O2、CCK-8、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（中国碧云天试剂公司）;β-肌动蛋白（β-actin）、Bcl-2、Caspase-3单抗（美国Epitmics公司）;ECL化学发光试剂盒（美国millipore公司）;脂质体2000转染试剂（美国Invitrogen公司）;二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（美国Thermo公司）;miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RNase-free ddH2O、逆转录试剂盒（德国QIAGEN公司）。RT-PCR检测仪（美国ABI公司）， 流式细胞仪（美国BD公司）， 酶标仪（美国Bio-Tek公司）。
　　1. 2 细胞培养 配置含10%胎牛血清的DMEM培养基， 加入H9C2心肌细胞， 置于37℃、5% CO2培养箱中培养。每隔2～3 d细胞传代1次。在实验前24 h取对数生长期的H9C2心肌细胞换液备用。
　　1. 3 细胞分组及转染 将培养好的H9C2心肌细胞分为空白对照组、阴性对照组、miR-1 inhibitor组、miR-499 mimics组。除空白对照组外， 阴性对照组、miR-1 inhibitor组、miR-499 mimics组H9C2心肌细胞分别采用随机合成的miRNA片段、miR-1 inhibitor片段、miR-499 mimics片段通过脂质体2000转染试剂进行转染， 浓度均为200 nmol/L， 处理时间均为6 h。转染结束后将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养， 48 h后收集细胞。 　　1. 4 RT-PCR检测转染情况 采用miRNeasy Serum/plasma Kit试剂盒提取血清RNA， 并检测RNA的纯度。采用逆转录试剂盒将miRNA逆转录为特定的cDNA， 并置于-80℃冰箱保存备用。RT-PCR反应：应用制备好的cDNA作为模版， 分别配置空白对照组、阴性对照组、miR-1 inhibitor组、miR-499 mimics组反应管， 以U6作内参。采用ABI 7500软件分析熔解曲线， 用2-△Ct计算miRNA基因相对表达量。
　　1. 5 实验分组及H2O2处理 设置空白对照组、H2O2组（未进行转染的H9C2心肌细胞）、干预组A（miR-1 inhibitor转染的H9C2心肌细胞）、干预组B（miR-499 mimics转染的H9C2心肌细胞）、干预组C（miR-1 inhibitor+miR-499 mimics转染的H9C2心肌细胞）。除空白对照组外， 其余四组H9C2心肌细胞均采用200 μmol/L的H2O2处理6 h。
　　1. 6 CCK-8法检测细胞增殖情况 取对数生长期的H9C2心肌细胞， 接种到96孔板中（1×104个细胞/孔）， 置于37℃、5% CO2培养箱中， 培养12 h后， 待细胞贴壁， 将H2O2处理后的各组细胞加入贴壁均匀的96孔板中， 用CCK-8进行处理并继续置于37℃、5% CO2培养箱中培养。2 h后震荡5 min， 在570 nm波长处测定各组细胞的吸光度（OD）值。
　　1. 7 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取H2O2处理后的各组细胞， 经磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后， 消化， 离心， 收集细胞。在收集到的细胞沉淀中加入200 ?l binding buffer并吹打成单细胞悬液， 再分别加入浓度为250 μg/ml的Annexin V-FITC和PI试剂各5 μl， 避光室温下反应5～15 min， 在1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　1. 8 Western Blot检测Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平 取H2O2处理后的各组细胞， 加入裂解液处理30 min， 收集蛋白并用蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度， 煮沸10 min使蛋白变性， 上样， 按20 μg/泳道蛋白量经12% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）， 以5%脱脂奶粉封闭60 min， 分别加入β-actin、Bcl-2、Caspase-3特异性抗体（均按照1∶1000稀释）， 4℃孵育过夜。次日用PBS-T液洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗， 室温孵育2 h后增强化学发光法（ECL）进行显色， 曝光后采用Image J软件分析各个条带的光密度， 目标蛋白相对表达量=目标条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
　　1. 9 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 两两比较采用LSD-t检验， 多组间比较采用单因素方差分析;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 各组转染结果比较 miR-1 inhibitor组的心肌细胞miR-1表达明显低于空白对照组和阴性对照组， miR-499 mimics组心肌细胞miR-499表达明显高于空白对照组和阴性对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。空白对照组与阴性对照组的miR-1与miR-499表达比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　2. 2 各组心肌细胞增殖检测结果比较 与空白对照组比较， H2O2组心肌细胞增殖显著降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）;与H2O2组比较， 干预组A心肌细胞增殖和干预组B心肌细胞增殖均升高， 干预组C心肌细胞增殖进一步升高， 但仍低于空白对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
　　2. 3 各组心肌细胞凋亡检测结果比较 与空白对照组比较， H2O2组细胞凋亡率显著升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）;与H2O2组比较， 干预组A、干预组B细胞凋亡率均明显降低， 干预组C细胞凋亡率进一步降低， 但仍高于空白对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。
　　2. 4 各组心肌细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平比较 与空白对照组比较， H2O2组心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平明显降低， 而Caspase-3蛋白表达水平明显升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）;与H2O2组比较， 干预组A和干预组B的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低， 但仍低于空白对照组， 而干预组C的Bcl-2蛋白表达水平进一步升高、Caspase-3蛋白表达水平进一步降低， 但仍高于空白对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表4。
　　3 讨论
　　miRNA是一种非编码RNA， 是可以影响转录后基因表达水平的调控分子[3]。人类基因组中约有30%基因受miRNA调控， 且同一种miRNA可能参与上百种基因的表达调节[4]。miRNA通过种子序列与信使RNA的3’非翻譯区互补结合， 从而调控基因表达。miRNA转录后诱导沉默复合体， 抑制信使RNA翻译， 或促进其降解， 从而抑制蛋白质翻译[5]。研究发现， 动物体内表达多种miRNA， 参与调节细胞增殖及凋亡， 参与心血管疾病进程[6]。
　　在众多凋亡基因中， Bcl-2蛋白家族发挥着重要作用， 是调控细胞线粒体凋亡途径的关键因子， 其中Bcl-2属于抗凋亡蛋白[7， 8]。Bcl-2可维持钙离子动态平衡、稳定细胞线粒体膜、拮抗促凋亡蛋白表达、控制细胞色素C和其他凋亡因子释放， 从而抑制细胞凋亡[9， 10]。有研究发现， miR-1可通过抑制Bcl-2表达促进心肌细胞凋亡[11]。 　　Caspase-3属于促凋亡蛋白， 是细胞凋亡过程的执行者， 在细胞凋亡的执行阶段及线粒体凋亡途径中具有重要作用， 也是内质网凋亡途径的最终凋亡因子， 只有Caspase-3表达增高， 才能说明发生了内质网凋亡。在心肌缺血缺氧状态下， Caspase-3可激活其前体， 启动细胞凋亡。有研究发现， miR-1可通过正性调控Caspase-3促进细胞凋亡[12]。
　　本次研究发现， 转染miR-1 inhibitor、miR-499 mimics心肌细胞， Bcl-2蛋白表达水平明显升高， Caspase-3蛋白表达水平明显降低， 而联合干预的Bcl-2蛋白表达水平升高幅度及Caspase-3蛋白表达水平降低幅度更为显著， 提示miR-1可能是通过下调Bcl-2、上调Caspase-3蛋白发挥促进心肌细胞凋亡作用， 而miR-499则相反， 通过上调Bcl-2、下调Caspase-3蛋白發挥抑制心肌细胞凋亡作用。
　　综上所述， miR-1与miR-499在心肌细胞增殖与凋亡过程中发挥重要的调控作用， 针对这两个环节进行干预有望成为将来临床治疗心脏疾病的新途径。
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　　[收稿日期：2020-01-21]
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