前列地尔对急性力竭大鼠心肌细胞缺血及凋亡的影响

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　　[摘要] 目的 观察前列地尔对急性力竭大鼠心肌细胞缺血及凋亡的影响。 方法 将24只雄性SD大鼠（SPF级）按随机数字表法分为对照组、力竭组、低剂量前列地尔预处理力竭组（前列地尔低剂量组）、高剂量前列地尔预处理力竭组（前列地尔高剂量组）。前列地尔低剂量组、前列地尔高剂量组分别给予前列地尔5、10 μg/（kg·d）腹腔注射7 d，对照组、力竭组给予0.9% NaCl 2 mL/（kg·d）腹腔注射7 d。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测缺血修饰白蛋白（IMA）。对大鼠心肌细胞进行TUNEL检测并观察计算凋亡指数（AI）。免疫组化法检测大鼠心肌Bax、Bcl-2含量。Western blot法检测大鼠心肌Fas、Caspase-3、Caspase-9含量。 结果 ①力竭运动大鼠血清IMA含量显著升高。与力竭组比较，前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组IMA明显降低（P < 0.05），且前列地尔高剂量组较前列地尔低劑量组降低更为明显（P < 0.05）。②力竭运动大鼠细胞凋亡明显增多。与对照组比较，力竭组和前列地尔低剂量组AI明显升高（P < 0.05）。前列地尔高剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），前列地尔高剂量组较力竭组和前列地尔低剂量组明显下降（P < 0.05）。③力竭组和前列地尔低剂量组的Bax蛋白表达较对照组明显升高（P < 0.05）。前列地尔高剂量组较力竭组和前列地尔低剂量组显著降低（P < 0.05）。力竭组和前列地尔低剂量组的Bcl-2蛋白量较对照组显著降低（P < 0.05），前列地尔高剂量组较力竭组、前列地尔低剂量组明显升高（P < 0.05）。④力竭组、前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组的Fas、Caspase-3较对照组均显著升高（P < 0.05），前列地尔高剂量组和前列地尔低剂量组较力竭组显著降低（P < 0.05）。力竭组Caspase-9高于对照组（P < 0.05），与力竭组比较，前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组Caspase-9明显降低（P < 0.05）。前列地尔高剂量组Fas、Caspase-3和Caspase-9均较前列地尔低剂量组显著降低（P < 0.05）。 结论 前列地尔可以减轻心肌细胞缺血，减少心肌细胞凋亡，对心肌细胞具有保护作用，且前列地尔对心肌细胞缺血保护及抑制凋亡的作用具有剂量依赖性。
　　[关键词] 前列地尔；急性力竭；心肌缺血；心肌凋亡
　　[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（c）-0018-05
　　The effects of Alprostadil on myocardial ischemia and apoptosis in acute exhausted rats
　　JIN Lili1 QIE Tao2 ZHANG Tongle1 XU Bei3
　　1.Department of Cardiology， Baoding First Central Hospital， Hebei Province， Baoding 071000， China； 2.Department of Emergency， Baoding First Central Hospital， Hebei Province， Baoding 071000， China； 3.Department of Pediatric， Baoding First Central Hospital， Hebei Province， Baoding 071000， China
　　[Abstract] Objective To observe the effects of Alprostadil on myocardial ischemia and apoptosis in acute exhausted rats. Methods Twenty-four male SD rats （SPF grade） were divided into control group （group C）， exhausted exercise group （group E）， low dose Alprostadil group （group L） and high dose Alprostadil group（group H） by random number table method. Group L and group H were respectively given intraperitoneal injection of 5 μg/（kg·d） and 10 μg/（kg·d） of Alprostadil for 7 days； and 0.9% NaCl 2 mL/（kg·d） was given intraperitoneal injection of group C and group E for 7 days. Ischemic modified albumin （IMA） was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. TUNEL detection of rat cardiomyocytes and the apoptosis index （AI） was calculated. The Bax and Bcl-2 in rat myocardium were detected by immunohistochemistry. The Fas， Caspase-3 and Caspase-9 in rat myocardium were detected by Western blot. Results ①The serum IMA levels of exhausted exercise rats were significantly increased. Compared with group E， the levels of IMA of group L and group H were decreased significantly （P < 0.05）. The levels of IMA of group H decreased more significantly than group L （P < 0.05）. ②Myocardial apoptosis was increased significantly after exhausted exercise. AI of group E and group L were significantly higher than group C （P < 0.05）. There was no significant difference between group H and group C in AI （P > 0.05）. Compared with group E and group L， AI of group H decreased significantly （P < 0.05）. ③The expression of Bax protein of group E and group L were significantly higher than that of group C （P < 0.05）. Bax of group H was significantly lower than group E and group L （P < 0.05）. Compared with group C， the expression of Bcl-2 protein of group E and group L significantly decreased （P < 0.05）. Compared with group E and group L， Bcl-2 of group H increased significantly （P < 0.05）. ④The Fas and Caspase-3 of group E， group L and group H were significantly higher than group C （P < 0.05）， while group H and group L were significantly lower than group E （P < 0.05）. The Caspase-9 of group E was higher than group C （P < 0.05）， compared with group E， the levels of Caspase-9 of group L and group H were significantly decreased （P < 0.05）， and the levels of Fas， Caspase-3 and Caspase-9 of group H were significantly lower than group L （P < 0.05）. Conclusion Alprostadil can improve myocardial ischemia， reduce cardiomyocytes apoptosis. And Alprostadil has a dose-dependent effect on myocardial ischemia and cardiomyocytes apoptosis. 　　[Key words] Alprostadil； Acute exhaustion； Myocardial ischemia； Myocardial apoptosis
　　适当的运动能提高机体适应力，促进代谢，对人体有益。剧烈运动、过度体力劳动甚至力竭性运动超出机体的承受能力，则会导致机体受损，而心脏是其中最为敏感的器官之一。力竭运动会导致心肌生化指标、形态结构发生病理性改变，甚至猝死[1]。研究表明，细胞凋亡参与了运动性心肌损伤[2]。前列地尔成分是前列腺素E1，属于天然的前列腺类物质。目前的药理研究表明，前列地尔不仅具有扩张血管、减轻心脏负荷的作用，同时有改善冠脉微循环、保护心肌细胞、抑制血小板聚集等作用[3-4]。更有研究显示，前列地尔可以减少心肌细胞凋亡，保护心肌细胞[5]。目前关于前列地尔对心肌细胞凋亡影响的研究较少。本研究观察了前列地尔对急性力竭大鼠心肌细胞缺血及凋亡的影响。现报道如下：
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物
　　雄性SD大鼠（SPF级）24只（塑料饲养笼，并配置不锈钢罩，每笼4只，分笼饲养，饲养温度21～24℃，自由饮水进食，光照时间每天12 h，5～7 d更换垫料），2月龄，体重（294.62±15.36）g。提供单位：河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003，合格证号编号：1703181。
　　1.2 仪器与试剂
　　前列地尔注射液（北京泰德制药有限公司，批号：H10980023）。MultiscanGO酶标仪（Thermo Fisher scientific，芬兰）；SIGMA 3K15高速冷冻离心机（Sigma-Aldrich，德国，离心力23 000 g）。酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E13620r）檢测缺血修饰白蛋白（IMA）；原位细胞凋亡（TUNEL）检测试剂盒（Roch公司，货号：11684817910）；Bax抗体（英国Abcam公司，货号：ab53154）；Bcl-2抗体（英国Abcam公司，货号：ab59348）；Fas/FasL抗体（美国SantaCruz公司，货号：sc-1023）；Caspase-3抗体（美国SantaCruz公司，货号：sc-7148）；Caspase-9抗体（美国SantaCruz公司，货号：sc-81663）；β-actin抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0061R）；二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：sp-9000）；ECL发光试剂盒（美国Piece公司，货号：32106）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 实验分组与动物模型建立 按随机数字表法将大鼠分为四组（n = 6）：对照组、力竭组、低剂量前列地尔预处理力竭组（前列地尔低剂量组）、高剂量前列地尔预处理力竭组（前列地尔高剂量组）。在大鼠适应性饲养期间进行3次无负重适应性游泳训练，每次20 min。适应性饲养1周后，前列地尔低剂量组、前列地尔高剂量组分别给予前列地尔5、10 μg/（kg·d）腹腔注射7 d，对照组、力竭组给予0.9% NaCl 2 mL/（kg·d）腹腔注射7 d。于给药结束后次日进行实验，正式实验前动物禁食12 h。实验时对照组不做任何运动，力竭组、前列地尔低剂量组、前列地尔高剂量组大鼠分别负重3%的锡丝，按Thomas力竭标准[6]游泳运动直至力竭（①大鼠沉入水下，无法返回水面，时间>10 s。②大鼠失去协调运动，在水中无方向性乱窜，即使没有达到10 s也可以定义为力竭。如大鼠短时间就出现力竭，将其从水中捞出休息5 min，继续使之游泳，确保其游泳时间至少2 h。密切观察大鼠游泳过程，防止呛水而致其意外死亡）。大鼠的力竭游泳槽为清洁塑料圆桶（60 cm×55 cm×50 cm）。水温为32℃（上下浮动不超过1℃）。
　　1.3.2 血清及心肌标本采集及制备 对照组及力竭运动后的大鼠立即行戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，开胸下腔静脉取血，3000 r/min，离心20 min，-80℃保存备用。取血后迅速将大鼠心脏取出，冷生理盐水洗净，迅速称重。在心尖部心室前壁肌切取200 mg心肌组织，在4%多聚甲醛中固定24 h后，用梯度浓度酒精行常规脱水、二甲苯透明，石蜡包埋后组织切片，6～8张，厚度为4 μm，用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片，56℃烘烤40 min备用。剩余心肌-80℃保存备用。
　　1.3.3 ELISA检测血清IMA含量 按照试剂盒操作具体步骤，测定每组血清中IMA含量，用酶标仪检测各孔450 nm处的OD值及标准品的OD值，根据OD值和浓度绘制标准曲线并计算各个样本浓度。
　　1.3.4 大鼠心肌细胞TUNEL检测与半定量分析 TUNEL检测是每一标本取3个不同部位的切片各1张，进行脱蜡，然后梯度水合后采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）缺口末端标记法检测。操作步骤按照试剂盒说明书进行。每张切片拍摄5个视野计数细胞数，每个视野计数100个阳性细胞数，以凋亡阳性细胞数所占百分比的平均值作为凋亡指数（AI）。
　　1.3.5 免疫组化检测大鼠心肌Bax、Bcl-2含量 采用SP法，按试剂说明书操作。每个标本在400倍光镜下随机取5个视野。阴性对照用PBS代替一抗。阳性反应：胞浆呈棕黄色背景，棕黄色颗粒沉积于细胞胞浆。阴性反应：细胞核及膜为蓝色，其他部分显示淡蓝色。观察每个视野中阳性细胞计数占总细胞计数的百分比。
　　1.3.6 Western blot法检测大鼠心肌Fas、Caspase-3、Caspase-9含量 各组在适量细胞裂解液（已做冰预冷处理）中分别加入200 mg大鼠左心室前壁心肌组织，冰上裂解40 min，4℃，12 000 r/min离心20 min，随后收集上清液，检测上清液蛋白定量（二喹啉甲酸法，BCA）。取蛋白样本进行SDS-PAGE电泳，100 V 2 h转PVDF膜，5% BSA封闭1 h，一抗稀释浓度为1∶200，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，随后加入二抗（1∶20 000）室温下孵育1 h，ECL检测试剂盒显影、洗片。用Bandleader 5.0软件对扫描后图像进行灰度值分析。 　　1.4 统计学方法
　　采用SPSS 16.0对所得数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）对多组间数据进行比较，并用LSD-t法或Dunnett′s T3检验进行进一步组间两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 前列地尔对力竭大鼠血清IMA的影响
　　与对照组比较，力竭组、前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组的大鼠血清IMA含量均显著升高（P < 0.05）。前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组IMA均较力竭组降低（P < 0.05），且前列地尔高剂量组较前列地尔低剂量组降低更为明显（P < 0.05）。见表1。
　　2.2 前列地尔对力竭大鼠心肌细胞AI的影响
　　TUNEL染色结果显示力竭组和前列地尔低剂量组AI较对照组明显升高（P < 0.05）。前列地尔高剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），前列地尔高剂量组较力竭组及前列地尔低剂量组明显下降（P < 0.05）。力竭组和前列地尔低剂量组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1、图1（封四）。
　　2.3 前列地尔对力竭大鼠心肌Bax、Bcl-2表达的影响
　　免疫组化法结果显示，力竭组和前列地尔低剂量组Bax阳性细胞计数百分比明显高于对照组（P <0.05）。前列地尔高剂量组较力竭组和前列地尔低剂量组显著降低（P < 0.05）。力竭组和前列地尔低剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1、图2（封四）。
　　力竭组和前列地尔低剂量组Bcl-2阳性细胞计数百分比明顯低于对照组（P < 0.05），前列地尔高剂量组较力竭组、前列地尔低剂量组明显升高（P <0.05）。力竭组和前列地尔低剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1、图3（封四）。
　　2.4 前列地尔对力竭大鼠心肌Fas、Caspase-3和Caspase-9的影响
　　力竭组、前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组的Fas、Caspase-3均较对照组显著升高（P < 0.05），前列地尔高剂量组和前列地尔低剂量组Fas、Caspase-3较力竭组显著降低（P < 0.05），前列地尔高剂量组较前列地尔低剂量组显著降低（P < 0.05）。力竭组Caspase-9高于对照组（P < 0.05），与力竭组比较，前列地尔低剂量组和前列地尔高剂量组Caspase-9明显降低（P < 0.05）。前列地尔低剂量组Caspase-9较对照组明显升高（P < 0.05），对照组和前列地尔高剂量组Caspase-9比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。前列地尔高剂量组Caspase-9较前列地尔低剂量组显著降低（P < 0.05）。见图4、表2。
　　3 讨论
　　随着社会发展进步，体育运动已逐渐成为人们日常生活的一部分，日益受到重视，适当的体育锻炼会对身体健康有益，而过度的体育锻炼、甚至力竭运动反而会对心脏造成损伤[7-8]。
　　IMA是反映心肌缺血的早期敏感指标。本研究显示，力竭运动会导致心肌缺血。力竭运动的大鼠较未进行力竭运动大鼠的IMA明显升高。而前列地尔用药组较未应用前列地尔组力竭大鼠的心肌缺血明显改善，且高剂量前列地尔较低剂量前列地尔改善效果更佳。这可能与前列地尔改善心肌微循环[9]、减轻细胞炎性反应[10]、改善血流动力学[11]等相关。
　　心肌细胞对缺血、缺氧非常敏感，在缺血、缺氧的情况下，炎性因子增多，脂质过氧化水平增加，细胞膜的稳定性及完整性被破坏，导致心肌细胞凋亡。本研究通过TUNEL染色观察了心肌细胞凋亡情况。研究结果显示，力竭运动的大鼠心肌细胞较未进行力竭运动的大鼠心肌凋亡数量增加。应用高剂量前列地尔的力竭大鼠的心肌细胞凋亡有明显改善，而低剂量前列地尔对心肌细胞凋亡的改善作用不明显。这表明，前列地尔可以减少心肌细胞凋亡[12]，且可能具有剂量依赖性。
　　Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中起到重要的作用。其中Bcl-2对凋亡起抑制作用，Bax对凋亡起到促进作用。当Bcl-2过度表达时，Bcl-2/Bax比值高，抑制细胞凋亡。本研究显示，力竭运动的大鼠Bcl-2显著降低，Bax显著升高。高剂量前列地尔力竭大鼠的Bax显著减低，Bcl-2显著升高。而低剂量前列地尔对Bcl-2、Bax的影响不明显。研究表明，前列地尔对心肌细胞凋亡有抑制作用，并且与剂量相关[5]。
　　Fas与FasL结合，诱导凋亡信号产生，激活Caspase-3、Caspase-9，导致细胞凋亡。本研究显示力竭运动大鼠Fas、Caspase-3、Caspase-9等相关凋亡蛋白表达显著升高。而高剂量前列地尔组较低剂量前列地尔组对力竭大鼠的心肌细胞凋亡蛋白表达有明显改善趋势，从而达到抑制心肌细胞凋亡的目的。
　　前列地尔是临床中应用多年的较为成熟的药物。最早应用于改善微循环病变[13-15]。近年随着临床研究的不断进展，发现前列地尔还具有调控血管内皮生长因子[16]、改善心肌细胞缺血/再灌注损伤[17-19]、抑制心肌纤维化[20]、抑制细胞凋亡[21-22]、减轻炎性反应[23-24]等多方面的作用。本研究发现，前列地尔具有抑制心肌细胞凋亡的作用。前列地尔在临床应用范围会越来越广泛。
　　本研究结果提示，前列地尔可以减轻心肌细胞缺血，减少心肌细胞凋亡，对心肌细胞具有保护作用，且前列地尔对心肌细胞缺血保护及抑制凋亡的作用具有剂量依赖性。
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　　（收稿日期：2018-11-08 本文编辑：张瑜杰）
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