茶皂素的分离纯化方法的初步研究

来源:用户上传      作者:湛咏诗 廖华卫 周雄坚

　　摘  要：目的 研究油茶饼粕中茶皂素的分离纯化方法。方法 采用紫外分光光度法对萃取法、薄层色谱分离法及柱层析法进行跟踪检测。结果 萃取后样品纯度35%，薄层板制备后样品纯度60%，柱层析后样品纯度86%。结论 茶皂素的初步研究效果較佳。
　　关键词：茶皂素  分离纯化  薄层色谱  柱层析
　　中图分类号：Q946    文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）10（a）-0032-02
　　Abstract： Objective： To study the separation and purification of tea saponin from Camellia oleifera. Methods：Ultraviolet spectrophotometry was used to detect the extraction method， thin layer chromatography and column chromatography. Results：The purity of the sample after extraction was 35%. The purity of the sample after preparation of the thin layer plate was 60%， and the purity of the sample after column chromatography was 86%. Conclusion： The preliminary study of tea saponin has better effect.
　　Key Words： Tea saponin; Separation and purification; Thin layer chromatography; Column chromatography
　　油茶籽榨取茶油后剩下的渣饼即为油茶饼粕，是茶油生产的下脚料茶皂素又名茶皂甙，是一种优良的非离子型天然表面活性剂，具有溶血、抗菌、抗病毒、抗应激、降血脂等多种生理活性，可广泛应用于日化、医药、食品和农药等行业。茶皂素是一类结构相似的齐墩果烷型三萜类皂苷混合物，其单体结构称为茶皂苷，由皂苷元、糖体、有机酸（或糖醛酸）3个部分组成。茶皂素为乳白色或淡黄色无定形粉末，平均分子式为 C57H90O26，相对分子量为1200～2800左右，熔点223℃～224℃，是一种非离子型极性物质[1]，该实验采取萃取、TLC色谱法、柱层析法等分离纯化方法，为建立茶皂素的分离纯化方法提供参考依据。
　　1  仪器与试剂
　　仪器：紫外可见分光光度计UV-6100S。
　　试剂：硫酸、香草醛、无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯茶皂素对照品（B20145，上海源叶生物科技有限公司）
　　2  方法与结果
　　2.1 油茶枯预处理及茶皂素的提取
　　2.1.1 油茶枯预处理
　　取油茶枯1kg，粉碎，于60℃条件下干燥4h，控制水分<5%，粉碎过60目筛，然后加一定量的石油醚（30～60），经索氏抽提至提取液无色，除去油脂。将除去油脂后的茶籽粕置于通风良好处使其自然风干，然后放入60℃烘干，备用。
　　2.1.2 茶皂素的提取
　　取2.1.1中油茶枯预处理好的样品100g置于2000mL的三角瓶中，按1∶10的比例加入50%乙醇，超声波提取，每次2h，提取3次。抽滤，滤液合并，回收乙醇，滤液水浴浓缩至200g即可（备用）。
　　2.2 茶皂素含量测定方法
　　2.2.1 标准曲线
　　取一个20mL容量瓶准确配制浓度2mg/mt的茶皂素标准溶液备用，用移液枪精确移取茶皂素标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分别放置于5个比色管中，并加水至溶液体积均为0.5mL。精密加入8%香草醛95%乙醇溶液0.5mL，将比色管置于冰水混合物中，移取77%的浓硫酸4mL加入比色管中，振荡后于60℃的水浴锅中水浴15min，然后将比色管放置于冰水混合物中反应10min，取出放置至室温，以试剂空白为对照，在其最大吸收波长550nm处测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，茶皂素标准溶液的浓度c（mg/mL）为横坐标，得到线性标准方程。
　　2.2.2 含量测定
　　取提取液0.5mL，置于比色管中，精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL，将比色管置于冰水混合物中，移取77%的浓硫酸4mL加入比色管中，振荡后于60℃的水浴锅中水浴15min，然后将比色管放置于冰水混合物中反应10min，取出使其恢复室温，以试剂空白为对照，在其最大吸收波长550nm处测定其吸光度[2]，依据2.2.1标准曲线计算含量。
　　2.3 样品液的萃取
　　将上述溶液置于1000mL的分液漏斗中，先用石油醚（60～90）萃取，每次200mL，共3次，合并萃取液，浓缩（备用）。再用乙酸乙酯萃取，每次200mL，共3次，合并萃取液，浓缩（备用）。最后用正丁醇萃取，每次200mL，共3次，合并萃取液，浓缩至干（备用）。
　　2.4 TLC色谱法
　　将上述正丁醇萃取部位的样品用热乙醇溶解，每次30mL，共3次，合并溶液。浓缩转移至10mL容量瓶中作为样品溶液（备用）。将样品溶液点于已活化好的10cmx10cm的薄层板上，在1.5cm处带状点样，在相应的位置点茶皂素对照品溶液，以乙酸乙酯-乙醇（1∶4）为展开剂展开，展开至约8.5cm处即可，取出，晾干，碘熏显色，用铅笔做好记号，取出，记号范围适当扩大，将吸附有样品的吸附剂按色带的位置刮下，收集好，置于层析柱上，用热乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至10mL（备用）。
　　2.5 柱层析分离纯化
　　将10g柱层析硅胶（100～200目）加入到上述溶液中，置于蒸发皿中，搅拌均匀，水浴蒸干，80℃烘干，备用。称取300g已经活化好的柱层析硅胶（100～200目），以乙酸乙酯-乙醇（4∶1）装柱，装好柱后用洗脱剂洗脱一天，干法上样，上好样品后在硅胶上加一团脱脂棉，打开活塞，进行洗脱，收集流份，每瓶约20mL，薄层色谱检测，合并茶皂素流份，回收洗脱剂，水浴蒸干，热乙醇适量溶解，滤过，放冷析晶。滤过，收集结晶，烘干，依样品测定方法测定含量。滤液也依样品测定方法测定含量。观察各自的含量情况，从而为摸索一个更好地分离纯化方法提供参考。
　　3  讨论
　　此次实验摸索了茶皂素的分离纯化方法，每一步都进行了跟踪检测，总体了解了茶皂素的占比情况，为以后进一步的研究提供技术支撑。此次实验可操作性强，容易学习领会，通俗易懂，萃取过程中，通过收集3种萃取溶液，分别跟踪检测，得到乙酸乙酯部位茶皂素占比约10%，正丁醇部位茶皂素占比约71%，剩余母液茶皂素占比约6%;薄层色谱制备中，展开系统选择很重要，层析板铺的好坏也对分离效果影响较大，跟茶皂素相应部位的斑点处刮下后处理得到的茶皂素占比约75%，为了更深入地了解茶皂素的占比情况，斑点之上之下分别检测，之上斑点处刮下的硅胶粉经处理后检测，经检测茶皂素占比约11%，之下斑点处刮下的硅胶粉经处理后检测，经检测茶皂素占比约4%;另外柱层析中，装柱的好坏也是分离效果好坏的较为重要的因素。但回收率偏低，下一步努力的方向。设想如果每一步重复做多一次，估计会提高样品的得率及纯度。
　　参考文献
　　[1] 邓桂兰.茶皂素的提取及纯化研究[J].食品研究与开发，2016，37（8）：197-204.
　　[2] 傅春玲，洪奇华，阮辉，等.茶皂素定量测定方法的研究[J].杭州大学学报：自然科学版，1997，24（3）：240-242.
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