药用兰科植物分子标记技术研究进展

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　　摘要    分子标记技术在鉴定植物遗传多样性上已被广泛使用。本文综述了常用的DNA分子标记（RAPD、AFLP、ISSR等）鉴定药用兰科植物遗传多样性的研究进展，指出了使用药用兰科植物分子标记的问题，并提出了分子标记在药用兰科植物资源保护和开发等方面的应用前景。
　　关键词    药用兰科植物;分子标记;遗传多样性
　　中图分类号    S567        文献标识码    A
　　兰科（Orchidaceae）植物是天门冬目的多年生草本植物，俗称兰花，亦叫胡姬花，是开花植物中最大、最具多样性的科，约800个属、25 000余种，广布全球，主产南美和亚洲的热带地区。我国有166属、1 000余种，南北均产，而以云南、海南、台湾种类最丰富。我国兰花资源中某些种不但具有很高的观赏价值，而且具有极高的药用价值，已知药用有76属、287个种[1]，如石斛、白及、黄花白及、天麻、金线莲、手参、石仙桃等。目前，大多数药用兰科植物是野生兰花，过度采挖使野生兰科植物的生境被破坏而导致野生资源已濒临灭绝。因此，对兰科植物的研究和保护工作已刻不容缓。本文综述了近年来利用分子标记技术研究兰科植物遗传多样性的应用与研究进展，为相关研究提供参考。
　　1    目前兰科植物利用分子标记的研究现状
　　1.1    RAPD技术的应用
　　朱勝男等[2]采用随机扩增多态性DNA技术对31种石斛属（Dendrobium）植物的遗传多样性进行分析。从100条RAPD引物中共筛选出18条引物，18条引物共扩增出1 082条带，其中多态性位点有261个，多态性比为99.2%。UPGMA聚类结果显示，基因型之间的相似系数分布于0.642～0.838之间，31种石斛属植物样品分为7类。聚类分析显示供试样品完全被区分开，试验结果与传统形态分类相似，但又有一定区别。苑  鹤等[3]利用RAPD分子标记对浙江义乌、天台、建德、武义，云南麻栗坡、勐海的14个居群的铁皮石斛和1个居群的紫皮石斛进行遗传多样性分析。从225个RAPD引物中筛选出15个引物，对105个铁皮石斛和3个紫皮石斛样本进行PCR扩增，共扩增出138条带，其中133条为多态性条带，多态性条带比率（PPB）为96.38%;14个铁皮石斛居群的多态位点（PPL）在10.79%～76.26%之间，平均为45.32%。结果表明，全国主产区人工栽培的铁皮石斛遗传多样性丰富，铁皮石斛种质的亲缘关系远近与其地理种源具有显著的相关性，与栽培地点无关。此外，金  波等[4]、邱  婧等[5]、任  羽等[6]也曾用RAPD技术对石斛的遗传多样性进行研究，也都获得了类似的结果，丰富稳定的扩增多态性证明，RAPD标记技术可以用于石斛属植物的分类、物种鉴定和遗传多样性研究。
　　王德信[7]以乌天麻、黄天麻和绿天麻3种变型为研究对象，通过RAPD分析研究天麻（Gastrodia elata Bl.）遗传多样性，采用改良的CTAB法提取天麻样品DNA，筛选出重复性好的10条随机引物，对130个样品的基因组DNA进行扩增，建立RAPD分析图谱。结果表明，54条为特异性带，多态性变异率高达65.1%，说明天麻变异程度较大。聚类分析表明，栽培群体乌天麻是一个高度混杂的群体，虽然个体的表现型基本相同，但从遗传物质的组成来看，基因型不一致。研究表明，天麻具有丰富的遗传多样性，其中乌天麻遗传多样性最丰富、变异复杂，为鉴定优质天麻品种、天麻种质资源合理有效利用和进行遗传育种提供了科学依据。
　　张  铁等[8]以文山地区药用金线莲原植物滇越金线兰（A.chapaensis）及3种叶面特征不同的花叶开唇兰为材料提取基因组DNA，选择适合的随机引物和PCR反应体系，扩增分析金线莲的带谱。结果表明，16条引物共得到108条带谱，其中有95条多态性谱带，多态百分比为87.96%，且4种材料都具特异性条带。由此表明，试验材料之间遗传差异性较大，花叶开唇兰可能已经形成了新的变型或变种。获得的特异性条带可用于区分干燥的金线莲药材。
　　黄宝华等[9]从100个随机RAPD引物中筛选出14个多态性较好的引物对15份虾脊兰（Calanthe）野生种进行了分析，结果表明，14个RAPD引物共扩增出254条带，其中多态性带243条，多态性比率为95.67%;15份虾脊兰野生种间的遗传相似系数的变幅为0.258 8～0.684 8，平均值为0.471 8，表明虾脊兰属植物的遗传多态性较丰富。
　　另外，王春香[10]用RAPD技术对斑叶兰（Goodyera schle-chtendaliana Rchb.f.）遗传多样性与群落优势种群生态位进行了研究。季祥彪等[11]用此技术研究了贵州野生春兰遗传多样性（表1）。
　　1.2    AFLP技术的应用
　　王慧中等[12]采用AFLP技术分析了13种石斛属植物的遗传多样性，选择性扩增引物组合E+ACT/M+CAC、E+AAC/M+CAC和E+ACA/M+CAC分别对这13种材料进行扩增，得到丰富的条带。在100～300 bp共得到346条带，多态性带342条，多态性百分率为98.8%。聚类分析结果表明，在相似系数0.54处，可将13种材料分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。Ⅰ类包括串珠石斛、铁皮石斛、广东石斛、重唇石斛、晶帽石斛、细叶石斛、滇桂石斛、报春石斛、玫瑰石斛、球花石斛;Ⅱ类包括鼓槌石斛;Ⅲ类包括美花石斛（花，浅红）、美花石斛（花，淡白）。AFLP分析结果与传统分类学的结果基本一致，表明该标记技术对石斛属植物的遗传多样性和分类研究是可行的。 　　关  萍等[13]从贵州、云南、四川、陕西和辽宁收集了27份天麻样品，从64对AFLP选择性引物组合中筛选出16对组合，对不同分布区天麻的遗传多样性进行分析。16对引物共产生548条大小在100～1 500 bp的谱带，其中多态性带428条，多态性比率（PP）达78%，说明不同分布区的天麻中存在一定的遗传多样性，且AFLP可以有效地进行天麻遗传多样性的分析。遗传差异分析结果表明，27个样品的遗传距离为0.018 7～0.593 0，平均为0.219 9，表明不同分布区天麻个体间存在一定的遗传差异。不同变型的AFLP分析结果显示，3种变型从分子上无明显差异，说明天麻种内的变型仅仅是表型上的变异，尚未在遗传上固定下来，对天麻几个变型的划分是否成立还有待进一步研究。程纪伦等[14]利用AFLP技术，采用8对M+3和P+3引物组合对23份贵州野生天麻品种进行了总基因组DNA水平上的多态性检测，用NTSYSpc-2.10s软件的UPGMA方法对检测结果进行聚类。结果共获得552条可统计的条带，其中396条呈多态性，多态性带百分率约为72%。UPGMA聚类可以将贵州不同产地的野生天麻很好地区分开来。其聚类分析结果表明，贵州野生天麻种质丰富的遗传多样性，多数来源地相同的天麻种质表现出较为密切的亲缘关系。此外，王晓丽等[15]、赵永亮等[16]、谢  渊等[17]也曾用AFLP技术对天麻的遗传多样性进行了相关研究。其结果表明，AFLP技术在天麻的种类划分、遗传多样性研究、亲缘关系鉴定上起到重要作用。
　　朱根发等[18]利用AFLP分析技术，从64对PstI/MseI引物中筛选出9对多态性引物组合，对来源于中国广东、福建、台湾的42个墨兰（Cymbid ium sinense Willd）品种进行了遗传多样性和亲缘关系分析，共扩增出1 384条带，其中多态性带1 333条，多态性率96.3%。平均每对引物扩增带数154条、多态性带数148条。所有的品种均可区分，其中39个品种具特征带或缺失带。墨兰品种间的遗传多样性丰富，品种间的Dice相似系数为0.422 2～0.824 5，平均相似系数为0.611 2。“达摩”系列芽变叶艺品种间的遗传多样性显著降低，多态性率为76.6%，平均相似系数为0.725 6。聚类分析表明，同一产地来源的品种基本上可聚为一类，反映出了品种间的亲缘关系。
　　管俊杰等[19]以羊耳蒜（Liparis japonica）幼嫩叶片为材料，采用常规SDS法提取基因组DNA，通过优化AFLP反应体系中的几个关键因素，建立适合羊耳蒜的AFLP银染反应体系，并利用筛选出的引物组合对羊耳蒜的遗传多样性进行初步研究。经EcoRⅠ和MseⅠ酶组合37 ℃酶切3 h后可将500 ng基因组DNA完全切开;酶切产物和接头经16 ℃连接过夜后，用带有1个选择性碱基的预扩引物和带有3个选择性碱基的选扩引物分别进行扩增，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染，能够得到清晰的扩增图谱。3对引物组合对8个羊耳蒜种群共185个体的扩增共得到221条条带，其中多态性条带195条，多态性条带百分率为88.24%。其研究结果表明，建立的AFLP反应体系可用于羊耳蒜种质资源遗传多样性研究（表2）。
　　1.3    ISSR技术的应用
　　卢家仕等[20]采用ISSR分子标记技术和非加权平均距离法（UPGMA）对24份不同产地石斛属样品的遗传多样性和亲缘关系进行分析，从100条ISSR引物中共筛选出6条多态性稳定、清晰的引物，24份石斛样品共扩增出847个DNA片段，平均每个引物扩增出141个DNA片段，其多态性为100%。将24份不同产地石斛样品划分为6个类群，遗传多样性非常丰富。杨春勇等[21]利用ISSR分子标记技术对9种药用栽培石斛的遗传多样性进行研究，从备选的引物中筛选出14条多态性引物，共检测到179个多态性位点，多态性比率为94.71%，ISSR标记检测结果显示，源于不同栽培地区栽培的的石斛属植物的遗传多样性非常丰富。马佳梅等[22]采用ISSR分子标记技术，对西双版纳分布的兰科濒危植物流苏石斛5个居群共114个个体的遗传多样性进行了研究。从100条引物中筛选出了12条用于扩增，共检测到117个位点，其中105个为多态位点。分析结果表明，流苏石斛居群水平遗传多样性较低，在物种水平上，流苏石斛多态位点百分率PPB为89.74%，Nei′s基因多样性指数H为0.322 7，Shannonc s多样性信息指数Hsp为0.477 9。通过ISSR分子标记技术对石斛的研究，更加确信分子标记技术对石斛的分类、遗传多样性与亲缘关系鉴定的显著作用。
　　关  萍等[24]利用ISSR分子标记技术，对分布于贵州的药用植物天麻的9个种群的遗传多样性水平和遗传结构进行分析，用12条ISSR引物共扩增出120条大小为200～1 600 bp的清晰谱带，其中97条具有多态性，总的多态位点百分率为80.83%，表明在物种水平上有较高的遗传变异;种群水平的多态性相对较低，多态百分率在17.5%～40.83%之间，平均25.56%。用POPGENE软件计算各种群间和种群内的遗传参数，结果表明，物种水平上的Nei′s遗传多样性（He）为0.042～0.153，平均为0.07 3;Shannon信息指数为0.332 6±0.224 1;Nei′s基因分化系数（Gst）为0.6377，表明种群间的遗传变异占总变异的63.77%，而种群内的遗传变异占总变异的36.23%，这与有限的基因流有关;而种群间有限的基因流（Nm=0.284 1）可能是由于种子的传播距离、种子极低的生活率以及种群间的地理隔离和营养繁殖等因素所致。
　　和志娇等[24]采用ISSR标记对14份小白芨（B.letilla form osana）、5份白芨（B. striata）、2份黄花白芨（B. ochracea）4份未确定种进行了遗传多样性的研究，从35个引物中筛选出12个能扩增出清晰带型并具多态性的引物，共扩增出了124条DNA片段，分子量在259～2 200 bp之間，平均每条引物扩增出10.33条DNA片段，多态性比率为87.90%，采用POPGENE软件，计算了种间的Nei氏距离，并用UPGMA法构建了系统树，这25份供试材料明显聚为3个大类，即小白芨、黄花白芨、白芨，与形态学的分类结果一致，其中根据4份未确定种的亲缘关系初步将其归入了不同的类群。25份白芨种质间的遗传距离为0.448 3～0.790 3。另外，UPGMA聚类结果表明，不同地理位置采集到的3种白芨样品种内和种间的遗传亲缘关有明显的差异。 　　刘翠华[25]以江西省建兰（Cymbidium ensifolium）为材料，采用ISSR分子标记进行遗传多样性分析，表明17个建兰居群遗传距离和地理距离相关性不显著（表3）。
　　1.4    其他分子标记技术的应用
　　樊洪泓等[26]利用SRAP分子标记技术进行药用石斛的遗传多样性研究。采用优化的SRAP反应体系，应用NTSYS軟件对9种石斛的SRAP-PCR结果进行分析，从中筛选得到40对多态性引物组合，共产生1 782条多态性条带，平均每个引物组合产生44.55条多态性条带，显示了较高的多态性比率。聚类分析40对引物组合的扩增结果，供试材料分为2个大类，Jaccard′s遗传相似系数为0.330 2～0.789 2。SRAP技术可应用于药用石斛的遗传多样性及亲缘关系的研究。
　　白  坚等[27]采用SRAP分子标记技术对来自四川、台湾、广东的47个建兰品种的遗传多样性进行分析，应用NYSYS软件对SRAP-PCR结果进行聚类分析。结果从88对引物中筛选获得12对特异性强、稳定性好的引物进行SRAP分析，共扩增出188条带纹，其中147条为多态性位点，平均每组引物扩增出12条多态性带。聚类分析表明，47个品种可以分为4个类群：第Ⅰ群由来自四川的3个品种组成;第Ⅱ群的23个品种中有18个来自四川、3个来自广东、2个来自台湾;第Ⅲ群的12个品种中有11个品种源于台湾，1个源于四川;第Ⅳ群仅有1个来自四川，其他品种均来自台湾。结果表明，由于人工驯化，造成了建兰品种遗传背景的混乱，而SRAP分子标记技术能有效地分析建兰品种的遗传多样性和亲缘关系（表4）。
　　2    目前存在的问题
　　2.1    尚未用到的分子标记技术
　　近年来，分子标记技术逐渐得到广泛利用，在药用兰科植物上也得到相应的发展。尤其以RAPD技术、AFLP技术、ISSR技术、SRAP技术常见。SSR技术的应用相对较少，其他技术，如RFLP技术、STS技术、TRAP技术、EST技术、SNP技术目前没有涉及。
　　2.2    尚未采用分子标记研究的药用兰科植物
　　目前，分子标记技术在石斛、天麻的研究应用中较为广泛，在其他药用兰科植物（如白及、金线莲、虾脊兰等）上的应用并不常见，而在很多种兰药用科植物（如手参、石仙桃、杜娟兰、岩蒜等）还未见相关研究的报道。
　　2.3    分子标记在实际应用中的问题
　　与传统标记（形态标记、细胞标记及生化标记）相比，分子标记有许多优点，其直接在DNA分子上检测生物间的差异，是在DNA水平上遗传变异的直接反映。但是，目前分子标记技术依然存在一些问题，主要有标记遗传图谱的局限性;与育种目标性状连锁分子标记的多态性频率较低;在DNA提取、定量和PCR扩增以及数据处理等方面的自动化程度较低，所需仪器设备及试剂价格昂贵。
　　每一种技术都有着一定的局限性，单凭一种分子标记技术的应用去研究其遗传多样性，在某一种或者某一类植物上去研究探讨是不够周全的。因此，需要结合多种分子标记技术，对不同类别的兰科植物进行进一步探索，积累更多的探究结果，从而更好地应用于兰科植物的遗传多样性研究，为兰科植物的分类、鉴定以及育种、人工营养繁殖奠定基础。
　　3    应用前景与展望
　　兰科植物中的石斛、天麻、白及、芋兰、金线兰、独蒜兰、杜鹃兰、手参等是国家重要的中药材，由于长期过度开发利用，药用兰科植物野生资源遭到严重破坏，有些种类的野生资源已近枯竭，加强保护我国药用兰科植物已迫在眉睫。
　　为了保护兰科植物，合理开发利用药用兰科植物种质资源，近年来不少学者致力于分子标记技术在兰科植物上的研究、应用。可以预见，随着高通量、低成本和高精度DNA测序新技术的发展，分子标记技术将会更好地应用于药用兰科植物的选择育种、品种改良以及种子纯度的鉴定，为研究遗传多样性、划分杂种优势群提供新方法，为其品种亲属关系鉴定、同一性鉴定提供有力依据。
　　4    参考文献
　　[1] 万发令，温英萍，李曙我，等.江西兰科药用植物资源的利用与保护[J].江西林业科技，2006（4）：41-43.
　　[2] 朱胜男，周振华，冯尚国，等.31种石斛属植物的RAPD遗传多样性分析[J].杭州师范大学学报（自然科学版），2011（4）：333-339.
　　[3] 苑鹤，林二培，朱波，等.铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性研究[J].中草药，2011（3）：566-569.
　　[4] 金波，蒋福升，施宏，等.石斛属野生种质资源的遗传多样性RAPD分析[J].中华中医药学刊，2009（8）：1700-1702.
　　[5] 邱婧，樊洪泓，李廷春，等.利用RAPD分析药用石斛的遗传多样性及亲缘关系[J].中国林副特产，2008（4）：9-11.
　　[6] 任羽，杨光穗，尹俊梅，等.石斛种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].中国农学通报，2007（6）：598-600.
　　[7] 王德信.随机扩增多态DNA技术在天麻遗传多样性分析中的应用[J].中国农学通报，2010（4）：19-24.
　　[8] 张铁，李洪超，刘伟.文山野生金线莲的RAPD鉴别[J].中药材，2009（3）：347-348.
　　[9] 黄宝华，钟凤林，刘添锋，等.15份虾脊兰属植物的遗传多样性研究[J].西南大学学报（自然科学版），2011（12）：72-76.
　　[10] 王春香.斑叶兰遗传多样性与群落优势种群生态位研究[D].重庆：西南大学，2008. 　　[11] 季祥彪，王国鼎，乔光，等.贵州野生春兰遗传多样性的RAPD分析[J].华中农业大学学报，2008（2）：297-302.
　　[12] 王慧中，卢江杰，施农农，等.13种石斛属植物遗传多样性的AFLP分析[J].分子细胞生物学报，2007（3）：205-210.
　　[13] 关萍，石建明，陈放.不同分布区天麻的AFLP分析[J].植物遗传资源学报，2013（1）：70-77.
　　[14] 程纪伦，范爱辉，苟占平，等.贵州野生天麻遗传多样性的AFLP指纹分析[J].时珍国医国药，2009（11）：2866-2868.
　　[15] 王晓丽，常楚瑞，宋聚先，等.天麻不同种质的AFLP和SSR分析[J].中华中医药杂志，2012（3）：555-558.
　　[16] 赵永亮，傅体华，范巧佳，等.野生天麻-栽培天麻的RAPD和AFLP标记遗传多态性分析[J].安徽农业科学，2008（17）：7119-7123.
　　[17] 谢渊，张小蕾，李毅，等.AFLP技术在天麻遗传变异研究中的初步应用[J].植物生理学通讯，2007（1）：141-144.
　　[18] 朱根发，李冬梅，郭振飞.中国墨兰品种遗传多样性的AFLP分析[J].中山大学学报（自然科学版），2009（3）：69-73.
　　[19] 管俊杰，丁锐，李梦媛，等.羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立与初步应用[J].中国农学通报，2012（36）：241-245.
　　[20] 卢家仕，卜朝阳，吕维莉，等.不同产地石斛属种质资源的ISSR遗传多样性分析[J].中草药，2013，44（2）：96-100.
　　[21] 杨春勇，李学兰，王云强，等.人工栽培石斛的ISSR标记分析[J].中国农学通报，2011（4）：148-152.
　　[22] 马佳梅，殷寿华.西双版纳地区流苏石斛遗传多样性的ISSR分析[J].云南植物研究，2009（1）：35-41.
　　[23] 和志娇，吕丽芬，杨丽云，等.白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].西南农业学报，2008（4）：1081-1085.
　　[24] 关萍，马丹炜，王贵侠，等.利用ISSR標记对天麻的贵州种群遗传多样性分析[J].北京林业大学学报，2007（6）：35-40.
　　[25] 刘翠华.江西省野生建兰的ISSR遗传多样性研究[D].南昌：南昌大学，2012.
　　[26] 樊洪泓，李廷春，邱婧，等.药用石斛遗传多样性的SRAP标记研究[J].中国中药杂志，2008（1）：6-10.
　　[27] 白坚，胡旭，周淑婷，等.47个建兰品种的SRAP遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报，2012（3）：376-380.
　　[28] 宋聚先，邹佳宁，王晓丽.天麻简单重复序列反应体系的初步研究[J].贵阳医学院学报，2006，31（6）：506-509.
　　[29] 张君毅，陈瑞凤.蝴蝶兰EST-SSRs分析[J].植物生理学通讯，2010，46（6）：559-563.
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