溴麝香草酚蓝法测定山豆根种子生活力的条件优化研究

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　　摘要    以山豆根种子为研究材料，以溴麝香草酚蓝（BTB）浓度、培养温度和培养时间为指标，分别通过正交试验、单因素试验测定山豆根种子的生活力，同时用Central Composite Design响应面分析试验对测定条件进行优化。结果表明，正交试验的最佳测定条件为BTB浓度0.2%、培养温度40 ℃、培养时间4 h，各因素对种子生活力测定的影响差异不显著;单因素试验和Central Composite Design响应面分析试验的最佳测定条件与正交试验结果一致。表明用响应面分析对BTB法测定山豆根种子生活力的条件进行优化是可行的。
　　关键词    山豆根;种子生活力;BTB法;响应面分析
　　中图分类号    Q945.34        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）06-0074-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　山豆根（Sophora tonkinensis）为豆科（Leguminosae）植物，以干燥根和根茎入药，为临床常用药，是多种药品的原料药材，本身具有清热解毒、消肿利咽的功效[1-2]。近年来，由于市场需求量的增加，野生资源遭到破坏，人工种植成为必需手段。山豆根主要采用种子繁殖，而种子生活力检测是判断种子是否具有繁殖价值的首选手段。因此，本研究采用正交试验、单因素试验及Central Composite Design响应面试验对BTB法测定山豆根种子生活力的条件进行优化，以期为后续种子研究和应用推广提供参考依据。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料
　　于2018年9月30日从安顺市紫云县猫营镇山豆根种繁基地采集种子，经贵州中医药大学药学院副教授檀龙颜鉴定为豆科植物山豆根种子。室内阴干后，于4 ℃保存备用。种子生活力测定试剂为溴麝香草酚蓝（BTB）。
　　1.2    试验方法
　　1.2.1    种子处理。去除种子中的杂质，选取无破损的种子置于烧杯中浸泡24 h后，将种皮剥除。
　　1.2.2    培养基制备。选取直径12 cm的培养皿，每个培养皿中倒入20 mL含0.1%琼脂的BTB培养基。
　　1.2.3    种子生活力测定。每个培养皿分别摆放50粒去皮种子，避光置于不同温度和时间条件下培养，相应对照培养皿中的种子置于沸水浴10 min后培养，以种子附近黄色晕圈的有无、大小和颜色深浅确定生活力大小。
　　1.2.4    正交试验。选取BTB浓度（A）（0.10%、0.15%、0.20%）、培养温度（B）（30、35、40 ℃）、培养时间（C）（2、3、4 h）为指标，每组50粒去皮种子，设计正交试验。
　　1.2.5    单因素试验。①培养温度试验：取50粒去皮种子，BTB浓度设置为0.15%，培养时间设置为3 h，培养温度设置25、30、35、40、45 ℃等5个水平。②培养时间试验：取50粒去皮种子，BTB浓度设置为0.15%，培养温度设置为40 ℃，培养时间设置1、2、3、4、5 h等5个水平。③BTB浓度试验：取50粒去皮种子，培养温度设置为40 ℃，培养时间设置为4 h，BTB浓度设置为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%等5个水平。
　　1.2.6    响应面分析试验。以BTB浓度（A）、培养温度（B）、培养时间（C）为变量，根据Central Composite Design设计原理，设计3因素5水平试验。每个处理50粒去皮种子。以种子生活力为响应值进行响应面分析。
　　1.3    数据分析
　　利用SPSS 17.0和Design Expert 8.0.6进行数据分析。
　　2    结果与分析
　　2.1    正交试验结果
　　各条件下山豆根种子生活力如下。0.1%×30 ℃×2 h：38.00%;0.1%×35 ℃×4 h：80.67%;0.1%×40 ℃×3 h：81.67%;0.15%×35 ℃×3 h：95.33%;0.15%×30 ℃×4 h：94.67%;0.15%×40 ℃×2 h：74.67%;0.2%×40 ℃×4 h：100.00%;0.2%×30 ℃×3 h：88.00%;0.2%×35 ℃×2 h：86.00%。测定条件0.2%×40 ℃×4 h的种子生活力最高，为100.00%;0.1%×30 ℃×2 h的种子生活力最低，为38.00%（表1）。方差分析显示各因素间差异不显著（表2）。
　　2.2    單因素试验结果 　　从表3可以看出，山豆根种子在培养温度25～40 ℃之间，生活力逐渐增大，40 ℃以后平稳，但45 ℃时晕圈颜色过度，不易观察，因而确定40 ℃为山豆根种子生活力BTB测定法的最佳培养温度。从表4可以看出，山豆根种子在培养时间1～4 h之间，生活力逐渐增大，5 h以后平稳，但培养5 h的种子培养基晕圈颜色过度，不易观察，因而确定4 h为山豆根种子生活力BTB测定法的最佳培养时间。从表5可以看出，山豆根种子在BTB浓度0.05%～0.20%之间，生活力逐渐增大，但BTB浓度为0.25%的种子培养基晕圈颜色过度，不易观察，因而确定0.20%为山豆根种子生活力BTB测定法的最佳BTB浓度。因此，单因素试验下山豆根种子生活力BTB测定法的最佳条件为0.20%×40 ℃×4 h，该结果与正交试验结果一致。
　　2.3    响应面试验
　　2.3.1    模型的建立与分析。表6为基于Central Composite Design试验设计及结果，将表6结果数据进行多元回归分析，结果见表7。经回归分析得回归方程：Y=94.88+24.42A+20.42B+18.91C-13.67AB-1.67AC-28.33BC-20.24A2-16.24B2-17.90C2。从表7可知，模型F值=133.46，且P<0.000 1，表明模型差异极显著。校正决定系数R2adj=0.984 3，相关系数R2=0.991 7，表明该模型的拟合度较好，可用于种子生活力的理论预测。模型的变异系数为2.89%（<10%），表明模型稳定性良好，试验操作可靠。模型的信噪比为37.474（>4），表明该模型能真实地反映试验结果。模型系数的显著性检验表明，A、B、C各因素对山豆根种子生活力测定影响差异极显著，且各因素的影响顺序为BTB浓度>培养温度>培养时间。
　　2.3.2    响应面分析。由图1可以看出，培养温度与培养时间的交互作用对响应值影响最大，响应面的倾斜度最高，其次是BTB浓度与培养温度（图2），最后是BTB浓度与培养时间（图3）。通过响应面分析优化，山豆根种子生活力BTB法测定的最佳条件为0.2%×40 ℃×4 h，此条件下，理论预测种子生活力为102.24%。在此条件下，进行验证，重复3次，实测种子生活力为100%。实测值与理论预测值的误差为2.24%（<5%）。因此，应用Central Composite Design响应面分析优化山豆根种子生活力BTB法测定条件是可行的。
　　3    结论与讨论
　　王  进等[3]以0.1% BTB、培养温度35 ℃和培养时间5 h为条件测定了锁阳（Cynomorium songaria）种子的生活力。本文对山豆根种子生活力测定发现，与锁阳种子生活力差异较大，因而对不同药用植物种子而言，3种因素对種子生活力测定的影响是不同的。响应面分析优化试验设计可补充正交试验设计和单因素试验设计的不足，使试验简便、精确、省力。
　　本文中响应面分析优化山豆根种子生活力测定的最佳条件为0.2%（BTB浓度）×40 ℃（培养温度）×4 h（培养时间），与正交试验和单因素试验的结果一致。在羊耳菊（Inula cappa）种子[4]和头花蓼（Polygonum capitatum）种子[5]生活力测定中，利用响应面分析优化相应测定条件也得到相似的结论，表明利用响应面分析优化山豆根种子生活力测定条件是可行的[6-7]。
　　4    参考文献
　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：第一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.
　　[2] 檀龙颜，马洪娜.山豆根繁殖与栽培技术的研究进展[J].种子，2017，36（8）：52-56.
　　[3] 王进，罗光宏，张勇，等.锁阳种子生活力测定及前处理的方法[J].植物生理学报，2014，50（1）：83-87.
　　[4] 成小璐，魏怡冰，魏升华，等.羊耳菊种子生活力的最佳测定条件[J].贵州农业科学，2016，44（8）：100-104.
　　[5] 王志威，魏升华，李俊，等.头花蓼种子生活力TTC法最优测定条件研究[J].南方农业，2018，12（25）：1-6.
　　[6] 陈泽贤，袁辉.种子活力测定方法研究进展[J].种子科技，2019，37（16）：25-27.
　　[7] 李月明，郝楠，孙丽惠，等.种子活力测定方法研究进展[J].辽宁农业科学，2013（1）：38-40.
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