分散液液微萃取-高效液相色谱法测定枸杞中拟除虫菊酯类农药残留研究

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　　摘要    本研究建立了分散液液微萃取-高效液相色谱法测定枸杞中溴氰菊酯和氰戊菊酯农药残留的检测方法，对萃取剂与分散剂的种类、萃取剂与分散剂的体积比、pH值、离子强度、萃取时间等影响因素进行了考察。结果表明，以甲醇为分散劑、三氯甲烷为萃取剂、萃取剂与分散剂的体积比为1∶4、pH值为7、萃取时间3 min、NaCl含量为2%时对枸杞中溴氰菊酯和氰戊菊酯萃取效果最佳。氰戊菊酯和溴氰菊酯分别在0.13～26.00 μg/mL（r=0.999 2）和0.17～34.00 μg/mL（r=0.999 8）浓度范围内线性关系良好，相对标准偏差为5.25%～5.80%。
　　关键词    枸杞;分散液液微萃取;高效液相色谱法;农药残留;溴氰菊酯;氰戊菊酯
　　中图分类号    O657.72;TS255.7        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）09-0104-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    A method for the determination of deltamethrin and fenvalerate pesticide residues in Lycium barbarum was established by dispersive liquid-liquid microextraction and high performance liquid chromatography.The influencing factors such as the types of extractant and dispersant，volume ratio of extractant and dispersant，pH value，ionic strength and extraction time were investigated.The results showed that when methanol was used as dispersant，trichloromethane as extractant，the volume ratio of extractant and dispersant was 1∶4，pH value was 7，the extraction time was 3 min，and the NaCl content was 2%，it had the best extraction effect for deltamethrin and fenvalerate in Lycium barbarum.Fenvalerate and deltamethrin had a good linear relationship in the concentration range of 0.13～26.00 μg/mL（r=0.999 2）and 0.17～34.00 μg/mL（r=0.999 8），respectively，and the relative standard deviation was 5.25%～5.80%.
　　Key words    Lycium barbarum;dispersive liquid-liquid microextraction;high performance liquid chromatography;pesticide residue;deltameth-rin;fenvalerate
　　拟除虫菊酯类农药是通过改变自然除虫菊酯的化学结构而衍生出的一类仿生杀虫剂，具有高效、性质稳定、广谱、使用浓度低、低毒、触杀作用强等特点，鉴于该类农药的诸多优点，其已逐渐取代有机氯、有机磷等农药而被广泛使用。但是，此类农药属于酯类，可透过皮肤黏膜、通过呼吸道等途径进入人体，可引起人体神经系统及皮肤类疾病。随着拟除虫菊酯类农药的大量使用，该类农药的神经毒性及致突变等潜在毒性逐渐表现出来，而且随着氟原子、氰基、非酯基团等的加入，其毒性被大大增强，由此产生的健康风险和制约中药材出口等问题受到人们的广泛关注[1-3]。
　　枸杞是一种药食同源植物，枸杞果具有明目、提高免疫力、降三高、促进胃肠蠕动等多种功效，其根、茎、叶、籽等也都具有很好的营养保健和药用价值[4]。近年来，随着人们对养生保健的重视，具有药食同源保健功能的枸杞市场需求量越来越大。但是，枸杞在种植过程中易受病虫害影响，种植户便大量使用各类农药，不合理施药会造成严重的农药残留，从而影响枸杞的质量和安全性。因此，建立农药残留的检测方法对于保障消费者的健康权益及促进我国中药的发展具有重要意义。
　　分散液液微萃取（Dispersive liquid-liquid microextracti-on，DLLME）具有设备简单、操作简便、环境友好、溶剂消耗少等优点，且能与高效液相色谱、气相色谱等多种仪器联用，现已广泛应用于中药材、食品、饮料、环境等的分析检测中[5-6]。本研究以分散液液微萃取为样品前处理方法，与高效液相色谱联用对市售枸杞中的溴氰菊酯和氰戊菊酯进行检测。 　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料
　　试验仪器：KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;HQ-60-I漩涡混合器（Beijing North TZ-Biotech Develop，Co. Ltd）;LG16-B高速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）;SPT12324A全自动氮空吹扫浓缩仪（北京斯珀特科技有限公司）;1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;ME104E电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;Milli-Q超纯水系统（德国默克密理博公司）。
　　试验药剂：100 μg/mL溴氰菊酯标准溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;100 μg/mL氰戊菊酯标准溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;乙腈（色谱纯，南京化学试剂有限公司）;甲醇（色谱纯，南京化学试剂有限公司）;丙酮（分析纯，南京化学试剂有限公司）;二氯甲烷（分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司）;三氯甲烷（分析纯，南京化学试剂有限公司）;四氯化碳（分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司）;1，2-二氯乙烷（分析纯，南京化学试剂有限公司）;试验中所用的水均为二次蒸馏水。
　　试验药材：枸杞样品，产地宁夏。
　　1.2    试验方法
　　1.2.1    标准溶液的配置。分别准确量取浓度为100 μg/mL的溴氰菊酯和氰戊菊酯标准溶液各0.80 mL，置于10.00 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，配制成浓度为8.0 μg/mL的贮备液，于0℃冰箱中保存备用。
　　1.2.2    供试样品溶液的制备。将枸杞样品冷冻干燥后置于粉碎机中粉碎，过60目筛，备用。准确称取枸杞粉末1.0 g，置于 50 mL具塞锥形瓶中，加入乙腈20.0 mL，超声提取40 min，过滤，收集滤液，4 ℃冰箱保存，备用。
　　1.2.3    分散液液微萃取。精密移取100.0 μL的枸杞样品提取液于1.5 mL聚四氟乙烯具塞尖底离心管中，加入2%NaCl溶液900.0 μL混匀，快速注入甲醇175.0 μL，再注入三氯甲烷45.0 μL，样品溶液、分散剂与萃取剂三者形成乳浊液，涡旋振荡后静置一定时间，3 200 r/min离心3 min。取出下层三氯甲烷相置于1.5 mL聚四氟乙烯具塞尖底离心管中，氮气吹干，用甲醇80.0 μL复溶，取10 μL进行HPLC分析。
　　1.2.4    高效液相色谱条件。色谱柱为依利特HypersilODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相组成为乙腈（A）+去离子水（B）;采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为0～14 min，74%～96%（A）;检测波长为230 nm;流动相流速为1.0 mL/min;柱温为25 ℃;进样量为10.0 μL。采用色谱峰保留时间定性。
　　2    结果与分析
　　2.1    DLLME条件优化
　　2.1.1    萃取溶剂选择。萃取剂对DLLME的萃取效果有显著的影响，合适的萃取剂取决于目标物的物理化学性质。萃取剂应该具备密度大于样品溶液、良好的色谱行为、对目标物有很好的萃取能力、与分散剂有良好的混溶性等特性[7]。本研究以甲醇为分散剂考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、1，2-二氯乙烷4种萃取剂对拟除虫菊酯类农药的萃取能力。由图1可知，三氯甲烷对枸杞中氰戊菊酯和溴氰菊酯的萃取效果均最好。因此，本试验选择三氯甲烷作为萃取剂进行后续试验。
　　2.1.2    分散剂选择。分散剂对萃取率也有重要的影响，其在DLLME中起着连接萃取剂与样品溶液的关键作用：溶解在分散剂中的萃取剂会因分散剂体积的扩张而被释放出来，当分散剂随着扩张溶于样品溶液时，萃取剂会部分析出，而萃取剂不会溶解于样品溶液，所以被分散成微小液滴的萃取剂会与样品溶液形成胶束状态[8]。本研究以三氯甲烷为萃取剂，考察以乙腈、甲醇、丙酮3种溶剂为分散剂时对枸杞中氰戊菊酯和溴氰菊酯萃取率的影響。由图2可知，甲醇为分散剂时，对枸杞中2种拟除虫菊酯类残留农药的萃取效果均最好，故本研究选择甲醇作为分散剂进行后续试验。
　　2.1.3    萃取剂与分散剂体积比选择。分散剂与萃取剂的用量会影响DLLME的富集倍数[9]。本研究固定分散剂与萃取剂的总体积为220 μL不变，考察分散剂与萃取剂的体积比分别为1∶1、2∶1、4∶1、10∶1、20∶1时对枸杞加标样品中氰戊菊酯和溴氰菊酯萃取效果的影响。分散剂与萃取剂以不同的体积比分别对相同的枸杞加标样品进行DLLME试验，萃取相均用氮气吹干，用甲醇80.0 μL复溶，取10 μL进行HPLC分析。由图3可知，当分散剂∶萃取剂=4∶1时，DLLME对2个目标物的萃取效果最佳。因此，以分散剂与萃取剂的比例为4∶1进行后续试验。
　　2.1.4    萃取时间选择。DLLME过程中，目标物在两相间实现传质平衡需要一定的时间，萃取时间太短，在目标物还未完全转入萃取相时就停止试验，会导致萃取不完全、萃取率低，但萃取时间过长会影响试验的效率，所以选择合适的萃取时间对于DLLME非常重要[10]。本研究考察了萃取时间分别为1、3、5、7 min时对氰戊菊酯和溴氰菊酯萃取率的影响。由图4可知，当萃取时间小于3 min时，萃取率随着时间的延长逐渐增大;当超过3 min时，氰戊菊酯的萃取率降低，溴氰菊酯的萃取率基本不变。故选择3 min为最佳萃取时间。
　　2.1.5    pH值选择。样品溶液的pH值会影响分析物的存在状态，使其处于分子或离子状态，从而影响萃取率[11]。已有文献报道，氰戊菊酯对热、潮湿稳定，在酸性介质中相对稳定，但在碱性介质中会迅速水解;溴氰菊酯对光和酸较为稳定，但在碱性介质中不稳定[12]。因此，本研究选择pH值为7.0进行后续试验。 　　2.1.6    离子强度选择。溶液的离子强度能影响目标物在水溶液中的溶解度，进而会影响萃取效果。本研究考察了NaCl含量分别为0%、1%、2%、3%和4%时对氰戊菊酯和溴氰菊酯萃取效果的影响。由图5可知，当NaCl含量为2%时，对氰戊菊酯和溴氰菊酯的萃取效果最佳。故选择2%为最佳盐浓度进行后续试验。
　　2.2    方法学验证
　　配制一系列不同浓度的氰戊菊酯和溴氰菊酯溶液，在最优试验条件下进行DLLME试验，同时对方法的线性范围、检出限、定量限和富集倍数等进行了考察，结果如表1所示。氰戊菊酯和溴氰菊酯分别在0.13～26.00 μg/mL和0.17～34.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好，标准曲线的回归方程分别为Y=23.566x-1.063 0（r=0.999 2）和Y=26.206x-0.409 4（r=0.999 8），相关系数均达到0.999以上。分别以信噪比的3 倍和10倍计算检出限和定量限，氰戊菊酯的检出限和定量限分别是0.04 μg/mL和0.13 μg/mL，溴氰菊酯的检出限和定量限分别是0.05 μg/mL和0.17 μg/mL。方法的精密度用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示，分别为5.80%（氰戊菊酯）和5.25%（溴氰菊酯）。
　　2.3    实际样品测定结果
　　本研究利用上述方法对市售枸杞样品进行分析测定，实际样品中未检测出2种农药残留。
　　3    结论
　　本研究建立了以分散液液微萃取技术作为样品前处理的方法，与高效液相色谱相结合，对枸杞中氰戊菊酯和溴氰菊酯2种拟除虫菊酯类农药残留进行富集检测。萃取剂为三氯甲烷，分散剂为甲醇，方法操作简便，有机溶剂使用量少，对环境友好，结果准确、可靠，可用于枸杞中拟除虫菊酯类农药残留的测定。
　　4    参考文献
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