高效液相色谱法测定清肺颗粒中甘草酸的含量

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　　摘要    利用高效液相色谱法测定清肺颗粒中甘草酸的含量。采用C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），在室溫下，以甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（66∶33∶1，V/V/V）为流动相，250 nm为检测波长，流速1.0 mL/min。结果表明，甘草酸在4.90～195.90 μg/mL范围内，线性关系良好（r=0.999 9），平均回收率为91.97%，RSD为3.41%。本方法简单快捷、精密度好，可用于控制清肺颗粒中甘草酸的含量。
　　关键词    清肺颗粒;甘草酸;HPLC
　　中图分类号    TS201        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）07-0222-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Determination  of  Glycyrrhizic  Acid  Content  in  Qingfei  Granule  by  HPLC
　　XU Shi-fu
　　（Anhui Provincial Control Institute of Veterinary Pharmaceuticals and Feed，Hefei Anhui 230091）
　　Abstract    The content of glycyrrhizic acid in qingfei granule was determined by HPLC.Using C18 column（5 μm，4.6 mm×250 mm）at room temperature，methanol-0.2 mol/L ammonium acetate solution-glacial acetic acid（66∶33∶1，V/V/V）was used as mobile phase，the detection wavelength was 250 nm，the flow rate was 1.0 mL/min.The results showed that the glycyrrhizic acid had a good linear relationship（r=0.999 9） in the range of 4.90～195.90 μg/mL，the average recovery was 91.97% and RSD was 3.41%.The method is simple，rapid and accurate，and can be used to control the content of glycyrrhizic acid in qingfei granules.
　　Key words    qingfei granule;glycyrrhizic acid;HPLC
　　清肺颗粒为兽药中常用中药颗粒剂，收载于《中国兽药典》2015年版二部[1]，由板蓝根、葶苈子、浙贝母、桔梗和甘草等药材组成，采用提取精制的方法制成，具有清肺平喘、化痰止咳之功能，临床主治肺热咳嗽，咽喉肿痛。目前，其质量标准仅对浙贝母、板蓝根、甘草和桔梗进行薄层色谱法鉴别。本文参考相关文献[2-3]，建立了测定清肺颗粒中甘草酸含量的高效液相色谱法。结果表明，本方法具有结果准确、快速分离、操作简便、专属性强、灵敏度高、重复性好等特点，可为有效控制清肺颗粒的质量提供参考。现将试验结果总结如下。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料
　　1.1.1    仪器和设备。U3000高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器，美国赛默飞;电子天平，BT-125D，德国赛多利斯;超纯水器，Milipo Simplicity，美国密理博;超声波仪，KQ-300DV，昆山市超声仪器有限公司。
　　1.1.2    试剂。甲醇为色谱纯;醋酸铵、冰醋酸为分析纯;水为超纯水，实验室自制。对照品：甘草酸铵，含量93.0%，批号110731-201619，购自中国食品药品检定研究院。清肺颗粒（每100 g相当于原生药100 g）3批，批号分别为20191101、20191102、20191103，来源于安徽XX生物科技有限公司。
　　1.2    试验方法
　　1.2.1    溶液制备。①对照品溶液制备。取甘草酸铵对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液，每1 mL含甘草酸铵1 mg（相当于含甘草酸0.979 5 mg）;吸取对照品贮备溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，每1 mL含甘草酸铵0.2 mg（相当于含甘草酸0.195 9 mg）。②供试品溶液制备。取研细的清肺颗粒粉末约2.25 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相约45 mL，超声25 min，放至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。③阴性对照溶液制备。按处方及制法制备不含甘草的阴性制剂，按上述供试品溶液制备方法，制备相应的阴性对照溶液。④溶液制备。0.2 mol/L醋酸铵溶液配制：取醋酸铵15.4 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，摇匀，即得。流动相配制：分别取甲醇、0.2 mol/L醋酸铵溶液、冰醋酸，按体积比（66∶33∶1）配制，混匀，过滤脱气，即得。 　　1.2.2    色谱条件。色谱柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流动相：甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（66∶33∶1，体积比）。流速1.0 mL/min;检测波长250 nm;进样量10 μL。
　　2    结果与分析
　　2.1    专属性试验
　　分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按1.2.2项下的色谱条件测定。结果表明，甘草酸峰与相邻峰分离良好，阴性对照色谱在与对照品色谱相同保留时间处无干扰峰，专属性强，能满足检测要求（图1～3）。
　　2.2    线性关系考察
　　吸取对照品贮备溶液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL，分别置于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得浓度为4.90、9.80、19.59、48.98、97.95、195.90 μg/mL的对照品系列溶液，分别取10 μL注入高效液相色谱仪。在1.2.2项下的色谱条件下测定，以峰面积Y为纵坐标，甘草酸浓度X（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，结果见图4，回归方程为Y=0.124 4X+0.014 7，R2=0.999 9。
　　2.3    稳定性试验
　　取供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h，按1.2.2项下的色谱条件测定峰面积，结果分别为11.313、11.342、11.282、11.388、11.361、11.378，平均11.344，RSD（n=6）为0.36%，表明在24 h内测定，其含量基本稳定。
　　2.4    精密度试验
　　取清肺颗粒（批号为20191101），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按1.2.2项下的色谱条件测定峰面积。连续测定6次，测得甘草酸铵峰面积分别为11.341、11.295、11.327、11.358、11.362、11.333，平均11.336，RSD（n=6）为0.21%，说明该方法重现性好。
　　2.5    准确度试验
　　取已知甘草酸含量的清肺颗粒，研细，称取9份，每份约1.125 g，分成3组，每组3份，分别加入一定的甘草酸铵对照品贮备溶液，3组分别以样品含量的80%、100%和120%为梯度添加。按供试品溶液制备方法制备，按1.2.2项色谱条件测定，以峰面积计算出甘草酸测得量。回收率计算公式：回收率（%）=（测得量-供试品中含量）/添加量×100。结果表明，甘草酸的回收率在87.09%～96.94%之间，平均回收率为91.97%（表1），RSD为3.41%。
　　2.6    样品测定
　　取清肺颗粒3批（批号分别为20191101、20191102、20191103），分别按供试品制备方法制备，按1.2.2项下的色谱条件进行测定，以峰面积用外标法计算甘草酸含量。结果表明，3批清肺颗粒中甘草酸的含量分别为2.015、2.013、2.009 mg/g。
　　3    结论与讨论
　　本研究选择高效液相色谱法测定清肺颗粒中甘草酸的含量，该方法快捷简便、准确可靠、重复性好、回收率高，可有效控制该制剂中甘草酸的含量，为清肺颗粒标准修订提供参考。
　　3.1    质控成分的选择
　　清肺颗粒收载于《中国兽药典》2015年版二部[1]，具有清肺平喘、化痰止咳功效，临床用于病毒感染引起的肺热咳嗽和咽喉肿痛。处方中含有板蓝根、葶苈子、浙贝母、桔梗和甘草等，其中甘草具有补脾益气、祛痰止咳等功效，对整个方剂具有重要的辅助作用，《中国兽药典》2015年版二部仅对浙贝母、板蓝根、甘草和桔梗进行薄层色谱法鉴别，选择测定其中甘草酸含量有助于对清肺颗粒进行质量控制。甘草中含有多种三萜类化合物、黄酮类化合物、生物碱等多种成分[4-5]，三萜类化合物中甘草酸（又称甘草皂苷）是主要活性成分，其含量一般不低于2%[1]。因此，选择测定甘草酸含量作为其中质控方法之一。本方法采用HPLC法测定清肺颗粒中甘草酸含量，操作便捷快捷，而且甘草酸在4.90～195.90 μg/mL范围内线性关系良好，检测方法的准确度、精密度、稳定性均能达到要求。
　　3.2    提取方法的选择
　　参考《中国兽药典》2015年版二部[1]甘草颗粒含量测定项下前处理方法，本试验采用酸性甲醇溶液作为提取溶剂，以超声的方式进行提取，试验时间选择20、25、30 min进行比较，最终选择流动相作为提取溶液，采用超声方式处理25 min。结果证明该方法提取效果好、速度快，而且阴性对照无干扰。
　　3.3    检测波长的选择
　　通过二极管阵列检测器进行扫描，甘草酸在（252±2）nm处有最大吸收，参考《中国兽药典》2015年版二部[1]，最终选择250 nm作为测定波长（图5）。
　　3.4    流动相的选择
　　笔者考察了不同比例的甲醇对分离效果的影响，通过调整有机相比例不断优化分离度和检测效率，发现随着甲醇比例的提高，甘草酸的保留时间不断缩短，在满足分离度要求的前提下，最终选择了甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（66∶33∶1）作为流动相，保留时间较短，分离度符合要求[6]。
　　4    參考文献
　　[1] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S].2部.北京：中国医药科技出版社，2015.
　　[2] 豆康宁，尚新彬，王飞.HPLC法测定甘草中甘草酸的含量与分布[J].中国食品添加剂，2017，5（2）：199-203.
　　[3] 孟庆山，王嘉伟，楚合法，等.高效液相色谱法测定甘草锌颗粒中甘草酸的含量[J].中国医药指南，2018，16（13）：28-29.
　　[4] 中国药科大学.中药辞海（第一卷）[M].北京：中国医药科技出版社，1993：1365.
　　[5] 程晓霞.甘草及其制剂中甘草酸的定量方法研究概况[J].时珍国医国药，2000，11（4）：380-381.
　　[6] 白梓静.高效液相色谱在中药含量测定中的应用[J].分析仪器，2014（6）：8-11.
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