超临界CO2萃取制备远志籽油工艺的优化及其成分鉴定

来源:用户上传      作者:黄晨 王青 刘超 杨清梅 马瑞 孙金月

　　 摘要：利用远志籽为原料，采用超临界CO2萃取技术，选择对远志籽油提取率影响较大的三种因素：萃取压力、萃取时间及乙醇夹带剂添加量，以提取率为考察指标进行正交试验，优化远志籽油的提取工艺;按照国标方法对制备的远志籽油的理化特性进行测定分析;采用薄层色谱法对远志籽油的甘油三酯结构进行初步鉴定;通过气相色谱法对远志籽油的脂肪酸成分进行分析。结果表明，远志籽的含油量为35.24%;超临界CO2萃取法萃取远志籽油的最佳条件为萃取压力30 MPa，萃取时间5 h，乙醇夹带剂用量25%，在此条件下远志籽油的提取率为95.6%;制备的远志籽油的酸价为1.79 mg KOH/g，过氧化值为5.75 mmol/kg，其基本理化特性符合国家四级食用油的标准。通过薄层色谱法初步鉴定，远志籽油中含有甘油三酯和sn-2-乙酰基甘油三酯两种组分;气相色谱法对远志籽油的脂肪酸成分分析结果表明，其籽油含有6种脂肪酸成分，其中油酸和花生一烯酸含量较高，分别为31.77%和49.46%，不饱和脂肪酸含量为82%。该研究结果将为远志籽油的开发利用提供参考依据。
　　关键词：远志籽油; 超临界CO2萃取;理化特性;脂肪酸成分;sn-2-乙酰基甘油三酯
　　中图分类号：S567.230.92文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2020）01-0148-06
　　Abstract Using polygala seeds as raw materials， the supercritical CO2 extraction technology was optimized by selecting three factors influencing extraction rate of polygala seed oil： extraction pressure， extraction time and ethanol entrainer addition amount. The orthogonal test was carried out with the extraction rate as an indicator to optimize the three extraction factors. The physical and chemical properties of polygala seed oil were determined according to the national standard methods. The structure of triglyceride in polygala seed oil was preliminarily identified by thin layer chromatography. The fatty acid composition of polygala seed oil was determined by gas chromatography. The results showed that the oil content of polygala seed oil was 35.24%. The orthogonal test results showed that the optimum conditions for extracting polygala seed oil were extraction pressure as 30 MPa， extraction time as 5 hours， and ethanol entrainer dosage as 25%. Under these conditions， the extraction rate of polygala seed oil was 95.6%. The acid value of polygala seed oil was 1.79 mg KOH/g， and the peroxide value was 5.75 mmol/kg. Its basic physical and chemical properties were in line with the national fourth-grade edible oil standard. The TLC analysis determined the presence of triglyceride and sn-2-acetyl triglyceride in polygala seed oil. By analyzing the fatty acids of polygala seed oil by gas chromatography， a total of six fatty acid components were obtained， among which， the content of oleic acid and peanut monoenoic acid were higher， and the contents were 31.77% and 49.46%， respectively; the unsaturated fatty acid content was 82%. The results provided a reference for the development and utilization of polygala seed oil.
　　Keywords Polygala seed oil; Supercritical CO2 extraction; Physical and chemical properties; Fatty acid components; sn-2-acTAG
　　 远志（Polygala tenuifolia Willd），别名葽绕、蕀蒬、线茶、草远志，属远志科多年生草本植物，作为中药材通常指细葉远志或宽叶远志的干燥根[1]。远志科包括30个属，约950种，分布于欧亚大陆和美洲的亚热带、温带地区;我国有42种及8个变种，山西、陕西、河北、河南资源较为丰富，山东、内蒙古、安徽、湖北、吉林、辽宁等地亦有分布[2]。远志性苦、辛温，入心、肾经，具有安神益智、祛痰、解郁之效，治惊悸、健忘、梦遗、失眠、咳嗽多痰、痈疽疮肿[3]。近年来，国内外学者对该属植物的化学成分和药理活性均展开了详细研究，对其化学成分的研究多集中于皂苷、远志山酮Ⅲ、寡糖脂类化合物、生物碱等方面[4，5]。远志籽来源广，资源丰富，但国内外对远志籽油的制备工艺研究及开发利用鲜有报道。 　　超临界CO2萃取技术是基于超临界状态下CO2溶解能力显著高于其临界点的一种新型分离技术，具有有机溶剂残留少、安全性好、无环境污染、操作方便、能源消耗少等优点[6]。与传统提取方法相比，超临界CO2萃取法采用的低温可有效保护萃取物的生物学特性，得到高品质的萃取物。国外已有采用索氏提取法提取远志籽油的报道[7]，但该方法提取效率低、有机溶剂残留多。而目前利用超临界CO2萃取法制备远志籽油的研究还未见报道。本研究采用超临界CO2萃取法提取远志籽油，以提取率为考察指标，优化了提取工艺，并对制备的远志籽油的理化特性及脂肪酸组成进行了分析，以期为远志籽油的开发利用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　远志籽、卫矛籽购于河北安国万草种业有限公司;大豆油购于益海嘉里食品营销有限公司;异丙醇、石油醚、正己烷（分析纯）购于北京百灵威科技有限公司;氯化钠、硫代硫酸钠、氢氧化钠、三氟化硼-甲醇、2’，7’-二氯荧光黄乙醇、氯化钙、Tris-缓冲液、胆酸钠、盐酸、乙醚（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　XMTD-8222型恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品;DZ30-32型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品;Speed SFE型快速溶剂萃取仪，美国ASI公司产品;YP802N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品;薄层层析硅胶板（100×200 mm），青岛海洋化工厂分厂产品;SB25-12 DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品;RE-2000E型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司产品;Agilent 7820A型气相色谱仪，安捷伦科技有限公司产品。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 远志籽油脂肪含量的测定 远志籽呈深褐色，有白色绒毛和明显的白色或奶油色假种皮。将远志籽洗净，60℃烘干，粉碎，过40～60目筛。采用索式提取法分析远志籽的油脂含量，称取10 g远志籽粉末，以石油醚（沸点30～60℃）85℃下回流8 h后，回收石油醚，将收集瓶烘至恒重后称量。
　　1.3.2 超临界CO2萃取远志籽油 称取10 g远志籽粉末，装入萃取釜，固定釜内温度40℃、阀门温度95℃不变，分别调节CO2压力15、20、25、30 MPa，萃取时间1、2、3、4、5 h，乙醇夹带剂添加量为远志籽粉末质量的5%、15%、25%、35%进行超临界CO2萃取。并按表1进行3因素3水平正交优化试验，以筛选出适合远志籽油的最佳提取工艺参数。萃取结束后，计算油脂提取率。
　　远志籽油提取率（%）=mM×ω×100
　　式中，m为萃取所得远志籽油的质量（g），M为萃取时所用远志籽粉末的质量（g），ω为远志籽的含油量（%）。
　　1.3.3 远志籽油的理化指标测定 远志籽油的相对密度、酸价、过氧化值、碘值、皂化值分别按照GB/T 5526—1985《植物油脂检验 比重测定法》[8]、GB/T 5530—2005《动植物油脂 酸值和酸度测定》[9]、GB/T 5538—2005《动植物油脂 过氧化值测定》[10]、GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》[11]和GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》[12]进行测定。
　　1.3.4 远志籽油的薄层色谱分析 油脂中极性不同的成分在薄层色谱中的Rf（迁移率）不同，甘油三酯、游离脂肪酸、1，3-甘油二酯、1，2-甘油二酯及单甘酯的极性依次增大，而在薄层色谱板上的移动距离依次减小，从而可根据移动距离确定各成分[13，14]。故采用薄层色谱法初步鉴定远志籽油中的油脂组成成分。
　　用毛细吸管取样，在距离硅胶板（100 mm×20 mm）下沿的1 cm处划线并点样，样品间保持适当距离;待样品干燥后，将层析板放入含有展开剂（正己烷∶ 无水乙醚∶ 乙酸=7∶ 3∶ 0.1，v/v/v）的层析缸中，当展开剂移动到距硅胶板上沿1 cm处时取出;待硅胶板上的展开剂挥发后，用喷雾器将显色剂喷涂在薄层板上显色2 min;254 nm紫外灯下观察甘油三酯等样品的位置，拍照记录，样品重复测试10次。
　　大豆油作为常见的甘油三酯型食用油，其甘油三酯含量达95%以上[15，16]，经薄层色谱鑒定，将大豆油作为高纯度的甘油三酯对照品使用。卫矛籽油（Euonymus alatus）中sn-3-乙酰基甘油三酯（sn-3-acTAG）可达总甘油三酯的98%[17]。故采用索氏提取法制得卫矛籽油，并通过柱层析法分离得到高纯度的sn-3-乙酰基甘油三酯，经薄层色谱鉴定与文献[17]结果一致，将柱层析法制得的卫矛籽油作为sn-3-acTAG的对照品使用。
　　1.3.5 远志籽油的脂肪酸组成分析 参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》[18]方法进行甲酯化;气相色谱仪色谱条件：色谱柱为Agilent DB-23石英毛细管柱（60 mm×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯度N2，烧气为 H2和空气，氢气流速 30 mL/min，空气流速 300 mL/min，氮气流速 30 mL/min，氢火焰离子化检测器（FID）;检测器温度：280℃;进样口温度：250℃;压力：0.24 MPa;进样量：1 μL。通过与脂肪酸甲酯标准品的保留时间进行比较，采用面积归一化法计算各脂肪酸成分的相对含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 超临界CO2法提取远志籽油单因素试验结果
　　2.1.1 萃取压力单因素试验结果 在固定萃取时间为5 h、乙醇夹带剂添加量为25%的条件下，远志籽油的提取率随着萃取压力的升高而逐渐提高，当萃取压力达到25 MPa后，提取率趋于平缓（图1），因此在25 MPa的萃取压力下远志籽油的提取率最佳。 　　2.1.2 萃取时间单因素试验结果 在固定萃取压力为25 MPa、乙醇夹带剂添加量为25%的条件下，萃取前4 h远志籽油的提取率随着萃取时间的延长而逐渐提高，之后，油脂提取率趋于平缓（图2）。推测萃取5 h，大部分远志籽油已被提出，再延长萃取时间对油脂提取率的影响很小。
　　
　　2.1.3 乙醇夹带剂添加量单因素试验结果 在固定萃取压力为25 MPa、提取时间为5 h的提取条件下，远志籽油的提取率随着乙醇夹带剂添加量的增大而提高，但当乙醇夹带剂添加量超过25%后，远志籽油的提取率趋于平缓（图3），继续增加乙醇夹带剂含量对提取率的影响不大，故乙醇夹带剂添加量为25%时远志籽油的提取率最佳。
　　
　　2.2 正交优化试验结果
　　在对压力、时间和乙醇夹带剂添加量单因素试验的基础上，进行正交优化试验，结果见表2。可知，超临界CO2流体萃取远志籽油的影响顺序为萃取压力>萃取时间>乙醇夹带剂添加量，最佳理论组合为A3B3C3。进一步进行试验验证，确定远志籽油的最佳提取工艺条件组合为A3B3C2，即萃取压力30 MPa、萃取时间5 h、乙醇夹带剂添加量为25%，此时远志籽油的提取率最高。
　　2.3 远志籽油的理化特性
　　经测定远志籽的含油量为35.24%。制备的远志籽油具有油脂的固有气味，无异味，呈金黄色，透明度好，但色泽较大豆油、花生油略深，可能是远志籽油含有的色素造成的。按照国标方法测定的远志籽油的部分理化指标结果见表3，可见，远志籽油的酸价较小，说明其游离脂肪酸含量较少，制备的油脂较为新鲜，油脂稳定性较好;过氧化值不高，说明远志籽油只被轻微氧化，含有的不利于人体健康的氧化产物较少。酸价<3 mg KOH/g，过氧化值<7.5 mmol/kg，符合国家四级食用油标准[19]。远志籽油的碘值为869.1 g/kg，低于食用较多的菜籽油（940～1 200 g/kg）、棉籽油（1 000～1 250 g/kg）、大豆油（1 240～1 390 g/kg）[19]等植物油，表明远志籽油的不饱和度较低，属于不干性油，适宜长期存放。远志籽油的皂化值小于200 mg KOH/g，推断油脂中脂肪酸分子量较小，易吸收。
　　2.4 远志籽油的薄层色谱鉴定
　　结果（图4）表明，薄层色谱谱带比较明显，斑点较为清晰，分离度高，效果好。通过与1号甘油三酯的迁移值对比发现，2号远志籽油中存在与甘油三酯基本一致的荧光斑点;且有比3号sn-3-乙酰基甘油三酯的迁移值略高的荧光斑点。根据这些结果可初步判定该荧光斑点类似sn-3-乙酰基甘油三酯，已被Smith等[20]鉴定为sn-2-乙酰基甘油三酯，因此本文不再进行进一步的鉴定。
　　
　　2.5 远志籽油的脂肪酸组成分析
　　远志籽油的脂肪酸组成分析结果见表4。根据总离子流色谱峰的峰面积经归一化定量分析，得到6种主要脂肪酸成分包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生一烯酸和花生二烯酸的质量百分含量，其中油酸和花生一烯酸含量较高分别为31.77%和49.46%，这两种长碳链脂肪酸占脂肪酸总量的80%以上。
　　3 讨论
　　超临界CO2萃取植物油脂的报道很多，应用非常广泛[21，22]。传统的压榨法制备的油脂虽然食用安全，但过程繁琐，残油率也较高;索氏提取法花费时间长，消耗试剂量大，挥发性溶剂污染环境，产品易存在有机溶剂残留，感官品质较差，色泽深、气味浓烈不好闻。本研究首次采用超临界CO2萃取技术制备远志籽油，工艺流程相对简单，萃取效率高，产品无溶剂残留，感官品质好，可满足高质量食品的要求。
　　萃取时间和萃取压力是影响超临界CO2提取油脂效率的两个最重要的因素[23]。一般来说，一定温度下，萃取压力越高，远志籽油在超临界流体中的溶解度越大，时间越长，提取率越高。但当温度、压力达到一定程度时，提取率虽然仍随着萃取时间的延长和压力的升高而提高，但提取率升高的幅度非常有限。另一方面，萃取压力过高不利于设备的维护，安全隐患加大。综合考虑，本试验条件下远志籽油的最佳提取工艺为萃取压力30 MPa，萃取时间5 h，夹带剂添加量为25%。
　　远志籽含油量为35.24%，其中不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的82.0%，不饱和脂肪酸含量较高，对于维护人体健康起着重要作用。远志籽油中油酸含量达30%以上，油酸为单不饱和脂肪酸，易被人体吸收，对心血管有着一定的软化作用;亚油酸含量为11.76%，也是人体必需脂肪酸，具有调节血脂代谢和动脉硬化等作用，也可用作乳化劑等表面活性剂[24]。制备的远志籽油中花生一烯酸的含量高达49.46%，它是一种不常见的ω-7系列的单不饱和脂肪酸。ω-7系列脂肪酸对人体健康具有多种功效，可降低炎症反应，调节血脂中的胆固醇和甘油三酯，降低人体血压疗效明显，可提高人体对胰岛素的敏感性，对糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化有一定功效，有助于抵抗炎症和控制体重等[25]。远志籽油不仅具有较好的营养价值，而且作为中药材，远志具有舒缓神经、消除痰液和缓解抑郁的作用[26]。目前对远志籽油在生物学、药物化学、药理学、药物学和临床应用上的研究较多，是一种具有很好发展前景的新型油料资源。
　　甘油三酯（triacylglycerol，TAG）是植物种子油的主要成分（占95%以上），由1个甘油分子和3个脂肪酸分子组成，脂肪酸占甘油三酯相对分子质量的95%以上。脂肪酸在甘油三酯骨架上的分布位置有两类：sn-1，2（α）和sn-1，3（β）[16]。附着在甘油三酯骨架上的脂肪酸类型不同，油脂的天然理化性质也不同。研究表明[27，28]，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布对油脂的营养品质有着重要影响，决定着甘油三酯在体内的吸收代谢过程。前期我们研究[20]发现，远志籽油中的sn-2-乙酰基甘油三酯与甘油二酯的结构具有一定的相似性，甘油二酯在降血脂、减少内脏脂肪和抑制体重增加方面具有重要作用[29，30]，推测sn-2-乙酰基甘油三酯也具有相似的功能，对于其功能，目前我们正在进行动物水平的验证。综上所述，远志籽油中不饱和脂肪酸含量较高，含有独特的脂肪酸成分及乙酰基甘油三酯，具有很大的开发利用价值。 　　4 结论
　　采用超临界CO2萃取法提取远志籽油，通过正交试验得到的最佳提取条件为：萃取压力30 MPa、萃取时间5 h以及25 %乙醇夹带剂添加量，在该条件下远志籽油提取率为95.60%;理化特性鉴定表明，制备的远志籽油酸价、过氧化值较低，属于不干性油，符合食用油的国家安全标准;薄层色谱鉴定表明，远志籽油中含有甘油三酯和sn-2-乙酰基甘油三酯两种组分;气相色谱法分析远志籽油的脂肪酸成分表明其油酸和花生一烯酸含量较高，占脂肪酸总量的80%以上。
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