响应面法优化金花葵微波萃取工艺研究及香气分析

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　　摘要：为了研究金花葵（Hibiseusmanihot L.）在烟草、香料等方面的开发和应用，以响应面法对微波萃取金花葵干花的工艺条件进行优化，并对其挥发性成分进行了分析鉴定。在单因素试验基础上，选择预处理加水量、萃取时间、萃取压力为影响因素，以金花葵提取率为响应值，采用Box-Behnken试验设计建立数学模型进行响应面分析，采用同时蒸馏提取装置收集挥发性成分并用气相色谱-质谱仪进行分析和鉴定。结果表明，最佳提取条件为预处理加水量为1∶2.5（g∶mL），萃取时间为85 min，萃取功率为520 W，金花葵提取率为0.290%。共鉴定出45种化合物，主要成分为（E）-9-二十碳烯、β-谷甾醇、亚麻酸、棕榈酸、乙酸、n-十八碳七氟丁酸酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、（3β）-麦角甾-5，24-二烯-3-醇、豆甾醇、9-十九碳烯等。微波萃取法可作为萃取金花葵烟用香料的有效方法，工艺稳定、可行。
　　关键词：金花葵（Hibiseusmanihot L.）干花;微波萃取;响应面试验;挥发性成分;气相色谱-质谱法
　　中图分类号：TQ461         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）01-0126-05
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.028           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： In order to study the development and application of Hibiseusmanihot L. in the fields of tobacco， flavor and fragrance industries，the process of microwave-assisted extraction to make tobacco flavor from Hibiseusmanihot L. was optimized by response surface methodology （RSM）， and its volatile components were analyzed and identified. Based on single factor experiment， with water addition at pretreatment， extraction time， extraction power as factors， and the yields of Hibiseusmanihot L.tobacco flavor as response value， the mathematical model was established by Box-Behnken Design（BBD）for response surface analysis. The volatile components were collected by simultaneous distillation and extraction device， analyzed and identified by gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that the extraction yield of Hibiseusmanihot L.could be 0.290% when extracted 85 min 520 W power and the water addition at pretreatment was 1∶2.5. 45 components were identified and mainly of： 1-Docosene， β-Sitosterol， 9，12，15-Octadecatrienoic acid， n-Hexadecanoic acid， Acetic acid， n-octadecylester， 1，2-Benzenedicarboxylic acid， mono（2-ethylhexyl） ester， 26，26-Dimethyl-5，24（28）-ergostadien-3.beta.-ol， Stigmasterol， et al. It suggested that the microwave method could be used as an effective method to extract the flavor of Hibiseusmanihot L.
　　Key words： dried Hibiseusmanihot L.; microwavemethod; response surface methodology; volatile components; GC-MS
　　金花葵（Hibiseusmanihot L.）又名菜芙蓉，也稱野芙蓉，为一年生草本锦葵科秋葵属植物，有的地区别名叫黏干或山榆皮。2003年8月被中国农业科学院在河北邢台发现，是濒临绝种的植物。近年来，人们发现金花葵全草含有丰富的黄酮、多糖等成分，具食用、药用、保健功能，有很高的利用价值[1-6]，开始进行大量种植。对金花葵花、子、叶中黄酮、总糖及生物活性物质有研究[7-15]，但多数集中在常规溶剂提取。此外，付伟等[16]采用了酶解法萃取金花葵花中多糖，宋琳琳等[17]采用了超声波提取法提取金花葵花中总黄酮。关于金花葵花的微波萃取法鲜见文献报道。微波萃取技术是一种很有潜力的萃取技术，在传统萃取工艺基础上进行了强化传热、传质，具有装置简单、应用范围广、萃取效率高、重现性好、消耗溶剂和时间少、污染少等优点，且微波萃取目前已有工业化生产设备。本试验采用响应面法优化金花葵烟用香料的微波萃取工艺条件，并采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对提取物进行组分分析，以期为金花葵的开发利用提供参考。 　　1  材料与方法
　　1.1  试剂与仪器
　　供试材料：金花葵干花（河北）。
　　试剂：95%乙醇（食品级）;无水硫酸钠（AR，广东汕头市西陇化工厂）;二氯甲烷（AR，天津市博迪化工有限公司）。
　　仪器：微波萃取装置（意大利MILESTONE公司NEOS GR型）;气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司Agilent 6890N/5975型）;电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司BUCHIR-3000型）;循环水式真空泵[巩义市予华仪器有限责任公司SHZ-D（Ⅲ）型]。
　　1.2  方法
　　1.2.1  金花葵微波萃取  将金花葵原料以适量水浸湿，投入微波萃取装置中，保持一定的萃取功率进行萃取，提取结束后收集分离釜中的提取物，所得提取液经过处理，使用旋转蒸发仪减压蒸馏，浓缩物即为金花葵烟用香料。提取得率按式（1）计算。
　　提取得率=金花葵烟用香料质量（g）/金花葵原料质量（g）×100%     （1）
　　1.2.2  提取物香气分析
　　1）GC-MS分析。称取1.00 g样品，以10 mL二氯甲烷溶解，加入适量无水硫酸钠置于4 ℃冰箱脱水12 h后过滤。滤液使用气相色谱-质谱联用仪进行检测，仪器检测：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管柱，进样口温度240 ℃;载气He;恒压模式70 kPa;程序升温：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至260 ℃，保持15 min;进样量0.5 μL;分流比25∶1;传输线温度280 ℃;电离方式EI;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度160 ℃;质量范围35～455 aum;溶剂延迟2 min。
　　2）检测模式。SCAN和SIM同步。
　　3）谱图检索。所得图谱经计算机谱库（NIST05，Wiley275）检索，并结合标准质谱图和有关文献[13，14]，确定挥发性成分，并用色谱峰面积归一化法测定得各挥发性成分的峰面积。
　　1.2.3  单因素试验
　　1）保持萃取功率为500 W，萃取时间80 min，考察不同预处理加水量[料液比（g∶mL，下同）1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4]对金花葵提取物得率的影响。
　　2）保持预处理加水量为1∶2、萃取时间80 min，考察不同萃取功率（150、250、350、450、550 W）对金花葵提取率的影响。
　　3）保持预处理加水量为1∶2、萃取功率450 W，考察不同萃取时间（40、60、80、100、120 min） 对金花葵提取率的影响。
　　1.2.4  响应面优化试验  在单因素试验的基础上，以提取率（Y）為指标，预处理加水量（A）、萃取时间（B）和萃取功率（C）为因素，按照响应面法的Box-Behnken Design（BBD）试验方案进行三因素三水平 15 个实验点的响应面试验，试验方案的15个实验点中包括12个析因点（1～12）及3个中心点（13～15），中心点重复的目的是估计整个试验的纯实验误差，以金花葵的提取率Y作为响应面分析的响应值。响应面试验因素与水平见表1。
　　2  结果与分析
　　2.1  单因素试验
　　2.1.1  预处理加水量对金花葵提取率的影响  不同预处理加水量对金花葵提取物得率的影响见图1。由图1可知，随着预处理加水量的增加，金花葵提取率提高，但当加水量达到1∶2后，继续增加萃取压力，金花葵提取率反而呈下降趋势。这是因为加水量增大，金花葵浸泡充分，对溶质溶解度增加，但继续增加水量，水分过多，在试验过程中会影响油分渗出，导致得率变低。因此，预处理加水量采用1∶2为宜。
　　2.1.2  不同萃取功率对金花葵提取率的影响  不同萃取功率对金花葵提取率的影响见图2。由图2可知，金花葵提取率随着萃取功率的升高而提高，这是因为萃取功率越大，温度越高，对溶质的溶解度越大，在萃取功率450 W时金花葵提取率达到最大，此后继续提高萃取功率，金花葵提取率基本无变化。因此，萃取功率以450 W为宜。
　　2.1.3  不同萃取时间对金花葵提取率的影响  不同萃取时间对金花葵提取率的影响见图3。由图3可知，萃取时间80 min内，金花葵提取率随着萃取时间的延长而提高，但当萃取时间超过80 min后，提取率变化不大。分析原因可能是萃取基本达到平衡，再继续延长萃取时间，成本增加。因此，选择萃取时间为80 min。
　　2.2  响应面优化试验
　　2.2.1  响应面优化试验结果  响应面优化试验结果见表2。
　　运用Design Expert 8.0.6软件对表2试验结果进行多元回归拟合，得金花葵子油得率与各因素的二次多项式回归模型见式（2）：
　　Y=-1.2135+0.176 63A+0.0180 44B+1.925×10-3C+1.05×10-3AB-1.375×10-4AC+6.625×10-6BC-0.044A2-1.412 5×10-4B2-1.925×10-6C2   （2）
　　对回归模型进行方差分析和回归系数显著性检验，结果见表3。三因素交互作用对金花葵提取率的响应面分析结果见图4至图6。
　　由表3数据和图4至图6可以看出，该二次回归方程模型极显著（P=0.000 3<0.01），失拟项不显著（P>0.05）;同时模型的决定系数R2为0.987 8，调整后R2为0.965 9，表明该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型是合适的，可以用此模型对微波法萃取金花葵烟用香料进行分析和预测。在所选取的因素水平范围内，各因素对结果的影响排序为萃取功率（C）>萃取时间（B）>预处理加水量（A）。由表3可知，一次项A（P=0.003 6<0.01）、B（P=0.002 6<0.01）和C（P=0.000 4<0.01）极显著，说明预处理加水量、萃取时间和萃取功率对金花葵提取率有极显著影响。二次项A2、B2和C2均达极显著水平（P<0.01），说明预处理加水量、萃取时间和萃取功率对金花葵提取率的影响不是线性关系。AB交互项极显著（P<0.01），AC、BC交互项显著（P<0.05），说明3个因素的交互作用对金花葵提取率有显著影响。 　　2.2.2  最佳萃取条件的预测和验证  通过Design Expert 8.0.6软件对回归方程求解，在试验的因素水平范围内预测微波萃取的最佳条件为预处理加水量1∶2.13、萃取时间85.18 min、萃取功率520.48 W，在此条件下金花葵提取率可达0.292%。为了方便生产操作，将微波萃取的最佳条件修正为预处理加水量1∶2.5、萃取时间85 min、功率520 W，在此条件下进行二次验证性试验，测得的金花葵提取率均值为0.290%，与理论预测值0.292%的相对误差很小，说明回归方程对微波法萃取金花葵烟用香料进行分析和预测非常可靠。
　　2.3  金花葵样品的挥发性成分分析
　　表4列出了GC-MS分离鉴定出的金花葵挥发性成分45种，用峰面积归一化法测定各组分的相对含量，主要成分为（E）-9-二十碳烯、β-谷甾醇、亚麻酸、棕榈酸、乙酸、n-十八碳七氟丁酸酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、（3β）-麦角甾-5，24-二烯-3-醇、豆甾醇、9-十九碳烯。
　　3  结论
　　响应面法预测金花葵微波萃取的最佳条件为预处理加水量1∶2.5、萃取时间85 min、萃取功率520 W，此时金花葵提取率可达0.290%，与理论预测值0.292%的相对误差很小，回归方程对微波法萃取金花葵烟用香料进行分析和预测非常可靠。对金花葵样品进行挥发性成分分析，共鉴定出45种化合物，主要成分为（E）-9-二十碳烯、β-谷甾醇、亚麻酸、棕榈酸、乙酸、n-十八碳七氟丁酸酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、（3β）-麦角甾-5，24-二烯-3-醇、豆甾醇、9-十九碳烯等。
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