响应面法优化野生白灵菇菌丝生长条件

来源:用户上传      作者:许俊齐 贾君 徐超 凡军民 谢春芹 曹淼 魏壮壮

　　摘要： 以新疆维吾尔自治区塔城县野生白灵菇为研究对象，探讨其菌丝培养阶段pH值、温度、碳源、氮源、碳氮比（C/N）对野生白灵菇菌丝生长特性的影响。结果表明，pH值为6.5～7.5条件下，白灵菇菌丝生长速度保持在相对较高水平，培养温度为24～26 ℃较利于白灵菇菌丝的生长;白灵菇菌丝培养良好的碳源为蔗糖、麦芽糖，氮源为蛋白胨、酵母浸膏;培养基中，C/N为20 ∶1时，菌丝生长速度相对最快。根据Box-Behnken中心组合试验原理，設计3因素3水平响应面试验对白灵菇菌丝生长条件进行优化，结果表明，菌丝生长较优的条件为温度24 ℃、pH值6.5、碳氮比21  ∶ 1，此条件下白灵菇菌落直径为58.13 mm，菌丝生长速度为4.79 mm/d，与预测值相符。
　　关键词： 白灵菇;菌丝特性;温度;碳氮比;pH值;响应面法
　　中图分类号： S646.1+40.4  文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）05-0137-06
　　 白灵菇（Pleurotus nebrodensis）别称天山白灵芝，担子菌纲伞菌目侧耳科侧耳属（Pleurotus）真菌[1]，子实体通体洁白，菇体肥大，盖厚柄粗，脆嫩可口，质地密实，香味浓郁，具有药用和保健功能。白灵菇营养丰富，人体必需的8种氨基酸含量相对较高，占其总氨基酸含量的35%，对提高人体非特异性免疫功能具有良好的促进作用，是一种珍稀的天然保健食品[2-7]，存在较好的市场潜力和经济效益。
　　 白灵菇在我国仅分布于新疆维吾尔自治区的干旱沙漠地区，故又有“天山神菇”“西天白灵菇”之称[8-9]，其中，新疆塔城县白灵菇具有朵型大、颜色洁白、产量高等特点。本试验以新疆塔城县白灵菇菌种为对象，探讨其菌丝培养条件及生长特性，以选育出适合江苏地区产业发展的菌株，增加江苏白灵菇品类，并改进其现有栽培技术，为新疆白灵菇的成功引种奠定基础。
　　 1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 供试菌种 白灵菇菌种，由新疆维吾尔自治区塔城县白灵菇种植基地提供。
　　1.1.2 仪器与设备 JA2003型电子天平，上海天平仪器厂生产;美的（Midea）WK2102型电磁炉，美的集团股份有限公司生产;HH-2型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司生产;SW-CJ-LF型净化操作台，圣欣科学仪器有限公司生产;LRH-150B型恒温培养箱，天津市中环实验电炉有限公司生产;XFS-280A型高压灭菌锅，上海尚道仪器设备有限公司生产。
　　1.1.3 基础培养基 蛋白胨2.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g，琼脂粉12.0 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH值。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 不同培养条件对白灵菇菌丝生长的影响 将菌龄与厚度基本一致、颜色洁白、直径为5 mm的白灵菇菌种圆片，分别接种到1个条件或物质发生变化、其他条件或物质相对固定不变的基础培养基上，相对湿度为75%～80%、25 ℃恒温培养箱中黑暗培养;待菌丝萌发，采用“十”字交叉法测定菌落直径，每隔12 h测量1次，连续测量5 d，测量10次，计算菌丝日均生长速率及菌丝长势。试验设置不同pH值为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5;设置光照培养箱不同温度为20、22、24、26、28 ℃;设置不同碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖;设置不同氮源为硫酸铵、酵母浸膏、硝酸钾、蛋白胨;固定基础培养基中蔗糖含量不变，变换蛋白胨含量，设置不同碳氮比（C/N）为10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1。每处理重复3次。
　　1.2.2 响应曲面试验设计 在单因素试验的基础上，分别以菌丝生长速度平均值、菌丝培养5 d时的菌落直径为响应值，采用响应曲面分析法对白灵菇菌丝生长温度、pH值、C/N这3个条件进行3因素3水平Box-Behnken中心组合试验。
　　1.3 统计分析
　　 采用Minitab数据处理系统、WPS 2016软件对试验数据进行统计，采用Duncans新复极差法进行差异显著性分析，利用Design-expert 8.0.6软件对响应曲面法获得的试验数据进行处理和回归分析。
　　 2 结果与分析
　　2.1 不同培养条件对白灵菇菌丝生长的影响
　　2.1.1 pH 值 由图1可知，白灵菇菌丝在pH值为4.5～8.5的培养基上均能生长，且菌丝生长速度在不同pH值条件下相互间差异不显著（P>0.05）;随培养时间的延长，白灵菇菌丝生长速度整体呈先增加后降低趋势，培养3 d时菌丝日生长速度相对最高，这可能与培养基中菌丝营养物质被逐渐消耗有关;pH值为8.5的较高pH值条件及pH值为4.5、5.5的较低pH值条件下，菌丝日生长速度相对较低，而pH值为6.5、7.5条件下，菌丝日生长速度保持在4.23 mm/d以上，且菌丝洁白、浓密。因此，白灵菇菌丝生长培养基相对最适合的pH值为6.5～7.5。
　　2.1.2 培养温度 由表1可知，在不同培养温度条件下，白灵菇菌丝生长速度存在明显差异;随培养温度的增加，白灵菇菌丝日均生长速度呈先增加后下降趋势，其中，24 ℃时菌丝生长速度达到最大，菌丝日均生长速度达到4.482 mm/d，与26、28 ℃培养的差异不显著（P>0.05），极显著高于22、20 ℃条件下培养的菌丝（P<0.01）;24、26 ℃条件下培养的白灵菇其菌丝洁白、浓密、粗壮，而28 ℃条件下培养的白灵菇其菌丝日均生长速度较24、26 ℃的有所下降，菌丝色泽偏黄，且较为稀松，28 ℃的温度条件已不适宜白灵菇菌丝生长。因此，白灵菇菌丝生长相对最适合的温度为24～26 ℃。 　　2.1.3 碳源 蔗糖、麦芽糖为双糖，常在培养基中被用作小分子碳源。由表2可知，白灵菇菌丝在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖这5种供试碳源培养基上均能生长，其中，以蔗糖、麦芽糖作为碳源相对较好，白灵菇菌丝日均生长速度相对较高，分别为4.504、4.450 mm/d，极显著高于其他3种碳源（P<0.01）;以葡萄糖、可溶性淀粉、果糖作为碳源培养白灵菇，其菌丝日均生长速度相互间存在显著差异（P<0.05），其中以果糖作为碳源的菌丝生长速度相对最小。因此，蔗糖、麦芽糖作为碳源较适合白灵菇菌丝的生长，综合考虑以蔗糖作为碳源白灵菇菌丝日均生长速度较为平稳，且价格低廉，较易获得，故选择蔗糖为白灵菇菌丝培养的较佳碳源。
　　2.1.4 氮源 由表3可知，白灵菇菌丝培养可利用硫酸铵、酵母浸膏、硝酸钾、蛋白胨作为氮源，但菌丝生长速度有明显不同，其中，酵母浸膏、蛋白胨作为氮源的白灵菇菌丝日均生长速度相对较高，分别为4.192、4.014 mm/d，对菌丝生长的影响相互间差异不显著（P>0.05），但极显著高于其他2种氮源（P<0.01）。观察菌丝外观发现，以硫酸铵、硝酸钾为氮源的白灵菇菌丝较为稀松、颜色浅白，而以酵母浸膏、蛋白胨为氮源的白灵菇菌丝浓密，且菌落直径明显大于其他2组。因此，白灵菇菌丝生长的较佳氮源为酵母浸膏与蛋白胨。
　　2.1.5 碳氮比 由表4可知，在不同碳氮比条件下，白灵菇菌丝都能生长，但菌丝生长速度有明显不同;C/N为20 ∶ 1时，白灵菇菌丝日均生长速度为4.378 mm/d，显著高于其他4个处理（P<0.05）;C/N为25 ∶ 1的白灵菇菌丝日均生长速度与C/N为15 ∶ 1的处理相互间差异不显著（P>0.05），C/N为10 ∶ 1的白灵菇菌丝日均生长速度与C/N为30 ∶ 1 的处理相互间差异不显著。观察菌丝外观状况发现，C/N分别为20 ∶ 1、25 ∶ 1培养基培养的白灵菇菌丝浓密健壮，菌丝生长优良。可见，白灵菇为典型的木腐菌，在营养生长阶段对碳源的需求相对较大，当C/N为20 ∶ 1时利于白灵菇菌丝的生长。
　　2.2 白灵菇菌丝生长条件的优化
　　2.2.1 响应曲面设计多元回归结果 采用Design Expert 8.0.6软件对表5试验结果进行多元回归拟合，得出温度（A）、pH值（B）、C/N（C）與菌丝生长速度（Y1）、菌落直径（Y2）这2个响应值之间不是简单的线性关系，而得到二次回归方程（模型）分别为：
　　Y1=4.78+0.10A+0.099B+0.066C-0.11AB+0.120AC+0.07BC-0.23A2-0.33B2-0.26C2;
　　Y2= 57.28+3.43A+0.420B+3.330C-0.23AB-0.205AC-0.07BC-5.94A2-4.36B2-5.24C2。
　　由表6可知，菌丝生长速度、菌落直径模型P值均<0.0001，影响极显著，失拟项P值分别为0.255 2、0.116 2，影响不显著（P>0.05），说明试验模型建立合理，试验设计可行，回归方程能准确反映温度、pH值、C/N比对白灵菇菌丝生长速度、菌落直径的影响;菌丝生长速度、菌落直径模型决定系数R2分别为0.986 6、0.989 8，调整决定系数R2Adj分别为0.969 4、0.968 0，说明模型拟合度较好，误差较小，可用于白灵菇生长条件优化试验的分析与预测;菌丝生长速度模型中，一次项A、B、交互项AC、二次项A2、B2、C2对模型影响极显著（P<0.01），一次项C、交互项AB对模型影响显著（P<0.05），交互项BC对模型影响不显著（P>0.05），而白灵菇菌落直径模型中，一次项A、C，交互项AC，二次项A2、B2、C2对模型影响极显著，一次项B，交互项AB、BC对模型影响不显著。
　　2.2.2 因素间的交互作用 响应面三维图可反映各因素之间的交互作用，响应曲面坡度越陡峭，说明响应值受到相应因素变化的影响较为显著。由图2、图3可知，温度、pH值、C/N各两因素对菌丝生长速度、菌落直径响应曲面较为陡峭，交互作用较为明显，与回归模型分析结果较为一致。
　　2.2.3 菌丝生长条件优化与验证 根据二次多项式回归方程，计算得到白灵菇菌落直径相对最大的条件为温度24.24 ℃、pH值6.02、C/N 21.35 ∶ 1，此条件下菌落直径预测值为58.152 9 mm;菌丝生长速度相对最优的条件为温度24.24 ℃、pH值6.565、C/N 21.05 ∶ 1，此条件下菌丝生长速度预测值为4.805 57 mm/d。为便于实际生产操作，将优化条件调整为温度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 1，此条件下测得的菌落直径为58.13 mm，菌丝生长速度为 4.79 mm/d，与Design-Expert 8.0.6得出的最优参数预测值较为吻合，可见该试验设计方法可靠有效。
　　 3 结论
　　 本试验结果表明，新疆维吾尔自治区塔城县白灵菇菌丝在不同pH值培养基上均能生长，其中，在pH值为6.5的培养基上白灵菇菌丝生长发育良好;适宜白灵菇菌丝生长的相对最佳温度为24～26 ℃，此条件下培养的白灵菇菌丝洁白、浓密、粗壮;白灵菇菌丝在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖这5种供试碳源培养基上均能生长，其中以蔗糖作为碳源相对最好，白灵菇菌丝日均生长速度较为平稳，且蔗糖价格低廉，较易获得;酵母浸膏是白灵菇菌丝生长相对较好的氮源，培养基中C/N为20 ∶ 1时更利于白灵菇菌丝的生长。
　　 在单因素试验的基础上，按照Box-Benhnken中心组合试验设计原理，分别以菌落直径、菌丝生长速度为响应值，以温度、pH值、C/N为影响因子设计3因素3水平响应曲面试验，对白灵菇菌丝生长条件进行优化，结果表明，得到的二次回归模型相关性极显著（P<0.01），准确度、精密度较高，并得出白灵菇菌丝最优生长参数为温度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 0，此条件下测得菌落直径为58.13 mm，菌丝生长速度为4.79 mm/d。
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　　收 稿日期：2019-01-24
　　基金项目：江苏农林职业技术学院科技项目——现代园艺工程技术中心平台建设（编号：2014KJ26）。
　　作者简介：许俊齐（1986—），男，陕西西安人，硕士，实验师，从事农产品加工及贮藏技术研究。E-mail：wozaijurong@163.com。
　　通信作者：贾 君（1966—），博士，教授，从事食品质量分析、农畜产品质量评价及加工研究。E-mail：772805883@qq.com。
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