改进高效液相色谱法测水产品中孔雀石绿残留量

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　　摘要：孔雀石绿是一种合成的三苯基甲烷类工业染料，曾被作为杀虫剂和杀菌剂广泛应用于水产养殖业。水产品中孔雀石绿残留量检测的国标方法GB/T 20361—2006在多年检测工作中发现有操作繁琐、回收率和精密度较差的缺点。试验比较了不同提取次数和净化次数对回收率的影响，改进了GB/T 20361—2006的前处理和色谱条件，减少提取次数和净化操作，降低了流速。改进后方法检测限为0.40 μg/kg，回收率提升至81.8%～100.8%，精密度为0.93%～8.32%，均达到并优于国标。
　　关键词：水产品;孔雀石绿;高效液相色谱法
　　中图分类号：TS254.7         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）17-0150-04
　　Abstract： Malachite green， as a synthetic industrial dye of triphenylmethane， has been widely used in aquaculture as an insecticide and fungicide. GB/T20361—2006 for the detection of malachite green residues in aquatic products was found that had some disadvantages， such as tedious operation， poor recovery and precision during years of testing. The effects of different extraction times and purification times on the recovery rate， and improved the pretreatment and chromatographic conditions of GB/T20361—2006，reducing the number of extractions and purification operations reduces the flow rate of the chromatographic method. The improved method has a detection limit of 0.40 μg/kg， a recovery rate of 81.8%～100.8%， and a precision of 0.93%～8.32%， which all meet and exceed the national standard.
　　Key words： aquatic products; malachite green; HPLC
　　孔雀石綠（Malachite green，MG）又名苯胺绿、碱性孔雀石绿、品绿、盐基块绿，是一种合成的三苯基甲烷类工业染料，被广泛用于制陶业、纺织业和皮革业。在20世纪30年代被广泛用作水产养殖业中的杀虫剂和杀菌剂，用来杀灭体外寄生虫和鱼卵中的霉菌[1]。但研究发现，MG的三苯甲烷结构可致癌，在鱼体脂肪组织中多以隐色孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG）（图1）形态长期残留，可通过食物链对哺乳动物和人类产生致畸、致癌、致突变等作用[2-4]。2002年MG就被列入《食品动物禁用兽药及其化合物清单》中，2005年7月7日，原农业部下发《关于组织查处孔雀石绿等禁用兽药的紧急通知》，随后，原国家质检总局、国家标准委发布GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》规定了水产品中MG及LMG的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱的测定方法，其中规定MG在水产品的检出浓度不得超过1.0 μg/kg。
　　目前，水产品中MG主流定量方法主要包括液相色谱法和液相色谱串联质谱法。液相色谱串联质谱法的优点是灵敏度高，缺点易受干扰，对人员和实验室硬件要求高，检测费用昂贵。液相色谱法中的GB/T 19857—2005[5]经氧化铅柱后衍生法操作繁琐，检出限较高，孔雀石绿（MG）与隐色孔雀石绿（LMG）检出限均为2 μg/kg，不能满足检测要求。GB/T 20361—2006[6]方法检出限为0.5 μg/kg，定性定量都较为准确，成为使用广泛的检测方法。该方法的缺点是操作较为繁琐，回收率不稳定，精密度较低。孙协军等[7]、王陈园等[8]改进后前处理步骤还是较为繁琐，刘少彬等[9]建立了超高效液相色谱法快速测定水产品中的MG和结晶紫方法，但该法对实验室硬件要求也较高。为此，本研究围绕改进现有方法GB/T 20361—2006的不足，通过优化前处理的提取、净化操作，提高回收率和精密度，为农产品质量安全监督抽查提供技术支撑。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品与试剂
　　样品：草鱼、加州鲈鱼、对虾，样品来源于某基地和市场。
　　试剂及耗材：MG（99.0%）和LMG（99.6%）标准品购于Dr.Ehrenstorfer公司;酸性氧化铝及PRS固相萃取柱（3 mL，500 mg，bond Elut）购于安捷伦科技有限公司。分析纯酸性氧化铝、硼氢化钾、乙腈、乙酸铵、对甲苯磺酸、盐酸羟胺（氯化羟胺）均购于国药试剂公司，色谱纯乙腈和甲酸购于默克化工技术（上海）有限公司。
　　1.2 主要仪器
　　液相色谱仪为岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配荧光检测器RF-20A， LC Solution工作站;Waters e2695高效液相色谱仪，配荧光检测器2475，Empower 3工作站;色谱柱为Thermo Acclaim C18与安捷伦ZORBAX SB-C18，规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm。 　　1.3 方法
　　1.3.1 标准溶液配制 分别称取MG和LMG标准品各0.01 g，用色谱纯级乙腈溶解，必要时使用超声波助融，定容至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃保存，有效期6个月，LMG标准品从固体溶解为液体需要加入极少量硼氢化钾以防止被氧化为MG，由于硼氢化钾不溶于纯乙腈，因此还需要加入少量超纯水。混合标准中间液使用乙腈稀释并用棕色容量瓶盛装，有效期3个月，上机使用的标准工作液使用乙腈稀释，现用现配。
　　1.3.2 样品制备 鱼去鳞，沿背脊取可食肌肉部分，虾去头、壳，取可食肌肉部分，切为小块，绞成鱼糜或虾糜，经GB/T 19857—2005液质法检测确认阴性，待用。
　　1.3.3 提取 称取（5.00±0.01） g鱼糜于50 mL离心管中，加入5.00 g酸性氧化铝和10 mL乙腈，振荡1 min，超声5 min，4 500 r/min离心5 min，将上清液倒入250 mL分液漏斗中;离心管中继续加入    10 mL乙腈，3 mL 0.2 mol/L硼氢化钾，振荡1 min，超声5 min，4 500 r/min离心5 min，上清液倒入   250 mL分液漏斗中;离心管中继续加入10 mL乙腈、1.5 mL 20%盐酸羟胺、5 mL 浓度为0.125 mol/L乙酸铵缓冲液、10 mL乙腈，振荡1 min，超声5 min，   4 500 r/min离心5 min，上清液倒入250 mL分液漏斗中。往分液漏斗中加入3 mL 0.2 mol/L硼氢化钾、2 mL二甘醇、20 mL二氯甲烷，盖塞，剧烈振摇1 min，静置分层，下层液体转移至鸡心瓶中，45 ℃旋转减压蒸餾至近干。
　　1.3.4 净化 将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝小柱，下端连接PRS小柱，5 mL乙腈活化。鸡心瓶中加入2.5 mL乙腈溶解残渣，将乙腈转移至萃取小柱上，依次过柱，再用乙腈清洗鸡心瓶2次，每次2.5 mL，依次过柱，弃去氧化铝小柱，在不抽真空的情况下，吹PRS柱至近干，然后加入3 mL等体积混合的乙腈和0.1 mol/L乙酸铵缓冲液洗脱，收集洗脱液，乙腈定容至3.0 mL，过0.45 μm滤膜，供液相色谱测定。
　　1.3.5 色谱条件 色谱柱Thermo Acclaim C18、安捷伦ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm;柱温35 ℃，流动相为乙腈∶0.125 mol/L乙酸铵缓冲液（9.64 g乙酸铵溶于1 L水，乙酸调pH为4.5）=80∶20，流速1 mL/min，进样量20 μL，激发波长265 nm，发射波长360 nm。
　　2 结果与分析
　　2.1 试验结果
　　在草鱼、加州鲈鱼、对虾阴性样品中分别添加MG和LMG，添加浓度分别为0.5、1.5、2.5 μg/kg，每个添加水平设6个平行样。加标后按照“1.3.3”的方法提取、“1.3.4”的方法净化，在“1.3.5”色谱条件下上机分析，根据色谱图各组分的峰面积，计算相应加标浓度的平均回收率和相对标准偏差（RSD），加标回收结果见表1。阴性样品色谱见图2，LMG加标色谱见图3，MG加标色谱见图4。
　　配制浓度为1、2、4、16、30、100 μg/L标准工作液，按“1.3.5”色谱条件进样测定，得到浓度（μg/L）与峰面积线性回归方程为y=2.977 3×105x+4.375 2×102，R2 =0.999 3，在1～100 μg/L线性良好。按信噪比S/N≥3为检测限，测得检测限为0.40 μg/kg。
　　2.2 前处理优化
　　按照GB/T 19857—2005[5]、GB/T 20361—2006[6]的提取方法称取5.00 g已绞碎样品至离心管中，加入提取剂超声提取后再匀浆提取。但试验发现，由于提取剂中主要成分是乙腈，能使样品中蛋白质变性，粘在匀浆机刀头上，即便多次洗刀头也很难洗净，尤其在蛋白质含量丰富的虾样前处理过程中特别严重。多次清洗刀头、匀浆过程中提取剂飞溅损失，都会严重影响回收率[10]。因此，将匀浆提取改为超声提取。
　　按照GB/T 20361—2006的方法共提取了4次，提取3次MG和LMG回收率为80%～90%;提取第4次时在液液萃取净化出现有机相和水相混溶、倒置，造成回收率低，平行极差，回收率相对前3次反而降低，甚至无法检出。刘少彬等[9]提出仅提取2次的前处理方法回收率在84.4%～98.4%，满足检测要求。但该方法省去了液液萃取步骤，需要真空浓缩，不能使用普通的减压旋蒸仪，对硬件要求较高。本试验加标回收发现，提取2次的提取回收率为42.0%～71.0%，明显低于提取3次的81.6%～93.8%，不能满足检测要求，因此，选择提取3次（表2）。
　　按照GB/T 20361—2006的方法使用二氯甲烷液液萃取净化2次，实际操作中，因为样品中脂肪等杂质影响，第2次萃取过程中经常出现乳化分层困难、有机相和水相混溶、倒置现象[11]，直接影响下一步旋转减压蒸馏，严重影响回收率和图谱基线（图5）。相比使用改进后方法（图3、图4），可以看出图5不同样品的基线和峰面积波动较大，直接影响检测结果。但如果不采用液液萃取分离水相和有机相，直接旋蒸浓缩提取剂，因提取剂中水分含量高，旋转减压蒸馏时特别容易出现爆沸。如果采取氮吹浓缩，因为提取剂量太多，提取剂大部分为乙腈且含水量高，耗时太长（至少1 h）且很难吹干。该方法只使用20 mL二氯甲烷液液萃取1次，节约了时间，避免因萃取水相和有机相分层困难、混溶、倒置造成的回收率损失。
　　2.3 仪器方法的优化
　　GB/T 20361—2006的方法流速为1.3 mL/min，容易造成色谱基线不稳定，影响目标物质的积分与定量（图5、图6）。改为1.0 mL/min后色谱基线相对平稳，对目标物质的积分影响较小（图7）。 　　3 小结与讨论
　　比较了国标方法GB/T 20361—2006中孔雀石绿残留量不同提取次数和净化次数对回收率的影响，优化了前处理和色谱条件，将原方法提取4次、液液萃取净化2次的前处理操作减少为提取3次净化1次，同时将色谱方法的流速从1.3 mL/min降低为1.0 mL/min，节省了前处理时间和试剂用量，提高了检测效率，降低了基质干扰，避免了原方法液液萃取造成的提取剂乳化、分层困难和回收率、精密度偏低的情况，同时使色谱基线更加稳定，对目标峰积分的影响更小。改进后方法检测限由原国标方法的0.50 μg/kg降低为0.40 μg/kg，回收率由原国标方法的70%～110%提升至81.8%～100.8%，精密度达到0.93%～8.32%，均达到并优于国标，值得普及推广。
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