离子交换高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的核苷酸

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　　摘 要：本研究运用离子交换高效液相色谱法对婴幼儿奶粉中的5种核苷酸进行了同时测定，结果表明，5种待测核苷酸在各自的浓度测定范围内线性关系良好（相关系数R2>0.999），方法检出限为0.9～2.0mg/kg，加标回收率为78.2%～113.4%，相对标准偏差小于5%。因此得出结论，该方法灵敏度高、定性干扰少、定量准确，可满足对婴幼儿奶粉中核苷酸检测的要求。
　　关键词：离子交换  高效液相色谱  奶粉  核苷酸
　　1 引言
　　核苷酸（Nucleotide）是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖，以及磷酸这3种物质组成的化合物，又称核甙酸，其对婴幼儿免疫功能、肠道功能、睡眠、脂类代谢、体格生长等方面起着重要作用[1]。奶粉中补充外源性核苷酸有助于改善人体肠道菌群、维持肠道的形态学及功能、促进生长发育、提高免疫力等，因此近年来一些国家陆续允许将核苷酸添加到婴幼儿奶粉中[2]。我国于2005年开始正式允许将核苷酸作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中，主要包括胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）等。《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》（GB 14880-2012）规定，核苷酸作为婴幼儿配方食品中的食品营养强化剂时允许使用量为0.12g～0.58g/kg（以核苷酸总量计）。本实验使用阴离子交换高效液相色谱法对上述5种核苷酸进行了同时测定，希望建立一种灵敏度高、干扰少、定量准确的测定方法，进而满足相关部门对婴幼儿奶粉中核苷酸检测的要求。
　　2 材料与方法
　　2.1 仪器与试剂
　　仪器：高效液相色谱仪（e2695），美国Waters公司;S220型pH计，瑞士Mettler-Toledo公司;超纯水纯化系统，美国millipore公司。
　　试剂：胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）标准物质，美国Stanford Chemicals公司;甲醇（色谱纯），德国默克公司;冰乙酸、乙酸铵（分析纯），国药集团。
　　混合标准储备液配制：分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP和IMP各5mg，用超纯水溶解转移至同一个100mL容量瓶中，纯水定容至刻度。此标准溶液浓度为：CMP、AMP、UMP各100μg/mL，GMP、IMP各50μg/mL。
　　2.2 试验方法
　　2.2.1 样品前处理
　　称取混合均匀的固体试样约5g（精确至0.1mg）置于100mL锥形瓶中，加入20mL热水（50～60℃）充分溶解试样，冷却至室温。用10%（V/V）醋酸溶液调试样溶液pH值至4.1后，将溶液移入50mL容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45μm微膜过滤备用。
　　2.2.2 液相色谱条件
　　色谱柱：Agilent ZORBAX  SAX（4.6mm×250mm，5μm）;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;进样量：10μL;流动相（梯度流脱）A：50mmol/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B：甲醇;梯度：0～25min、40%～100%A，25.0～25.1min、100%～40%A，25.1～30min、40%A。
　　3 结果与分析
　　3.1 液相色谱条件的选择
　　核苷酸是一类极性较大的化合物，当采用《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸测定》（GB 5413.40-2016）方法中的C18-T反相色谱柱进行分析时，很难达到较好的保留和分离，目标化合物的检测也存在杂峰干扰，影响定量。标准方法采用的流动相含有离子对试剂，长期使用不仅对色谱柱的损害较大，还会影响色谱柱的使用寿命。本实验通过将试样溶液的pH值调节为弱酸性，适当增加了溶液中的氢离子活度，促进了核苷酸的电离反应，使其在水溶液中呈离子状态，从而适用于离子交换分离模式，更可用离子交换色谱柱进行有效分离。
　　在流动相的选择上，本试验考察了不同pH值和不同浓度的磷酸二氢钾溶液对分离效果的影响。结果发现，pH值越小、分离越差，原因应为流动相酸度过大时，氢离子抑制了核苷酸的电离和流动相的电离，进而降低了洗脱能力。当流动相pH值大于5时，核苷酸显现多种电离形式，出现多于待测核苷酸种类的峰型，使分析变得困难。同时，流动相的洗脱能力会随流动相浓度的增大而增强。因此，实验需根据色谱柱的实际使用情况，优化流动相浓度以达到合适的保留时间，并保证足够的分离度。通过优化，本试验选择pH值为4.1的50mmol/L磷酸二氢钾水溶液作为流动相，通过梯度洗脱程序，在26min内完成了对5种核苷酸的分离。实际样品测定时，基质出峰较早，不会对目标物色谱峰产生干扰（色谱图见图1）。
　　3.2 方法的线性及检出限
　　分别吸取标准混合溶液2、4、6、8、10mL加纯水定容至50mL，配制成系列标准工作液，并以优化的液相色谱条件进入高效液相色谱进行分析。以待测核苷酸的浓度为横坐标（X），待测核苷酸峰面积为纵坐标（Y），进行回归分析，得到线性回归方程及各待测核苷酸的线性相关系数。配制接近检出限浓度的UMP、AMP、CMP、IMP、GMP标准溶液，计算信噪比，以3倍信噪比计算检出限（以称样5.0g、定容50mL计），结果见表1。结果表明，5种核苷酸在相应浓度范围内线性相关性良好，相关系数（R2）均大于0.999，检出限为0.9～2.0mg/kg，可满足检测要求。
　　3.4 回收率及精密度实验
　　以金领冠较大婴儿配方奶粉（6～12月龄，2段）为本底，进行低、中、高浓度加标，按“2.2.1”样品前处理方法处理样品，每个加标水平平行测定6次，计算3个加标水平下的回收率和相对标准偏差（RSD）。结果如表2所示，对奶粉样品UMP、AMP、CMP、IMP、GMP的回收率在78.2%～113.4%，RSD在0.3%～3.7%。结果表明，该方法具有良好的回收率和精密度，可以满足对奶粉产品中上述5种核苷酸日常检测的要求。
　　4结论
　　本研究通过优化高效液相色谱条件的参数，建立了一种基于离子交换原理的高效液相色谱法同时测定婴幼儿奶粉中5种核苷酸的方法。该方法具有前处理简单、干扰少、分析灵敏度高、定量准确等优点，可满足奶粉中核苷酸的检测需求，能夠为乳制品生产企业核苷酸含量的质量控制及食品安全抽样检测提供方法技术支持。
　　参考文献：
　　[1] 方芳，李婷，安颖. 核苷酸与婴幼儿健康[J].卫生研究，2019，48（6）：1017-1019，1040.
　　[2] 马奕，李勇.外源核苷酸对婴幼儿的营养作用及安全性的探讨[J].中国生育健康杂志，2009，20（3）：189-192.
　　[3] GB 14880-2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》[S].
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