反相高效液相色谱法测定不同煎煮时间夏枯草中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量

来源:用户上传      作者:张艳娇 黄宽 向润清 方山丹 董帅 范源

　　 摘要：目的  建立反相高效液相色谱法测定不同煎煮时间夏枯草中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量的方法，为夏枯草质量控制及临床应用提供参考。方法  采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长280 nm，柱温20 ℃，流速1.0 mL/min，测定夏枯草煎煮25、30、35、40、45、50 min时丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的含量。结果  夏枯草中丹参素在0.62～4.34 μg范围内呈线性关系（r=0.999 8），咖啡酸在0.48～3.36 μg范围内呈线性关系（r=0.999 9），迷迭香酸在0.40～2.80 μg范围内呈线性关系（r=0.999 8）。夏枯草中的丹参素及咖啡酸在煎煮时间为25 min时含量最高，煎煮40 min时迷迭香酸含量最高。结论  夏枯草中酚酸类成分在不同煎煮时间含量不同，本研究可为确定夏枯草的最佳煎煮时间及其质量控制提供参考。
　　 关键词：夏枯草;丹参素;咖啡酸;迷迭香酸;煎煮时间;反相高效液相色谱法
　　 中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）02-0064-04
　　 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903382
　　Contents of Salvianic Acid A， Caffeic Acid and Rosmarinic Acid in Bupleuri Radix by RP-HPLC at Different Boiling Time
　　ZHANG Yanjiao1， HUANG Kuan1， XIANG Runqing1， FANG Shandan1， DONG Shuai1， FAN Yuan1，2
　　1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;
　　2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650216， China
　　 Abstract： Objective To establish content determination method by RP-HPLC for salvianic acid A， caffeic acid and rosmarinic acid in Bupleuri Radix; To provide references for quality control and clinical medication of Bupleuri Radix. Methods The analysis was carried out on an Agilent C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）， and the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid aqueous with gradient elution. The detection wavelength was 280 nm， and the flow rate was 1.0 mL/min at column temperature of 20 ℃. The contents of salvianic acid A， caffeic acid and rosmarinic acid were measured when Bupleuri Radix was boiling for 25， 30， 35， 40， 45， and 50 min. Results The salvianic acid A in Bupleuri Radix was linear in the range of 0.62–4.34 μg （r=0.999 8）; the caffeic acid was linear in the range of 0.48–3.36 μg （r=0.999 9）; rosmarinic acid was linear in the range of 0.40– 2.80 μg （r=0.999 8）. The contents of salvianic acid A and caffeic acid in Bupleuri Radix was the highest when the boiling time was 25 min; the content of rosmarinic acid was the highest at 40 min. Conclusion The contents of phenolic acids in Bupleuri Radix change with boiling time， which can provide references for determining the optimal decoction time of Bupleuri Radix and its quality control.
　　 Keywords： Bupleuri Radix; salvianic acid A; caffeic acid; rosmarinic acid; boiling time; RP-HPLC
　　 夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，始载于《神农本草经》，有“主寒热，瘰疬，鼠瘘，头疮，破徵，散瘿结气，脚肿湿痹”之效。研究发现，夏枯草的主要化合物包括三萜类、酚酸类、黄酮类等，具有降压、免疫抑制、抗肿瘤、保肝、抑制胰脂肪酶活性等多种药理作用[1]。夏枯草中的酚酸类成分主要有丹参素、咖啡酸、迷迭香酸等。丹参素主要对心脑血管起到保护作用，且与肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤血管生成、肿瘤细胞浸润及转移的多种靶点相关[2];丹参素可显著抑制胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种癌细胞的生长和增殖[3]。咖啡酸能抑制多种肿瘤细胞的生长、分化、增殖，促进肿瘤细胞凋亡[4];另具有收缩微血管、增强凝血因子水平、升高白细胞、血小板及止血作用，还可用于多种与氧化应激、炎症反应、病毒感染相关的疾病[5-6];此外，还具有抗氧化、降低抗癌药物不良反应、防止和逆转化学物致癌、促进凝血和伤口愈合作用[7-9]。迷迭香酸是夏枯草中典型的酚酸类成分，可由一分子咖啡酸和一分子丹参素缩合而成，具有显著的抗氧化、抗病毒、抗炎、镇痛、抗感染和抗微生物特性[10]，可治疗内分泌疾病及抗神经退行性疾病等[11]，且具有显著的抗肿瘤活性[12-14]。 　　 原卫生部、国家中医药管理局2009年下发的《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号）规定：煎煮时间应当根据方剂的功能主治和药物功效确定，浸泡时间一般不少于30 min，一般药物煮沸后再煎煮20～30 min。本试验根据夏枯草中酚酸类物质的性质及丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的理化性质，测定不同煎煮时间夏枯草水溶液中3种物质含量变化，考察夏枯草的最佳煎煮时间，为临床用药提供参考。
　　1  仪器与试药
　　 BY-500A高速万能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司;Agilent 1200系列高效液相色谱仪（VWD紫外检测器），美国安捷伦公司;FA1004N型万分之一电子分析天平，上海菁海仪器有限公司;KDM调温电热套，常州国华电器有限公司;EYEL4型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;YL-080ST型超声清洗机，深圳市语路清洗设备有限公司。
　　 丹参素对照品（批号wkq18061906，含量≥98%），四川维克奇生物科技有限公司;咖啡酸对照品（批号160109，含量≥98%），四川维克奇生物科技有限公司;迷迭香酸对照品（批号S03N8H47130，含量≥98%），上海源叶生物科技有限公司。夏枯草样品于2018年采自云南省文山州广南县（编号5334210306），经云南中医药大学中药材优良种苗繁育中心实验室李国栋鉴定为唇形科夏枯草属夏枯草Prunella vulgaris L.。甲醇和乙腈均为色谱纯，水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
　　2  方法与结果
　　2.1  混合对照品溶液制备
　　 精密称取丹参素对照品3.10 mg、咖啡酸对照品2.40 mg、迷迭香酸对照品2.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，即得丹参素、咖啡酸、迷迭香酸对照品溶液。再分别取丹参素、咖啡酸、迷迭香酸对照品溶液5.2、2、5 mL，定容至10 mL容量瓶中，即得混合对照品溶液。
　　2.2  供试品溶液制备
　　 将夏枯草干燥果穗经高速万能粉碎机打粉，过5号筛，备用。分别称取样品粉末5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL纯净水，料液比为1∶20，置于同一圆底烧瓶、同一加热套，沸腾回流加热25、30、35、40、45、50 min，过滤，将滤液置于旋转蒸发仪上，60 ℃浓缩，分别加入70%甲醇溶液15 mL使溶解，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得不同煎煮时间夏枯草供试品溶液。
　　2.3  色谱条件
　　 采用ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温20 ℃，检测波长280 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，流动相为乙腈和0.1%磷酸，梯度洗脱，洗脱程序见表1。色谱图见图1。
　　2.4  线性关系考察
　　 取“2.1”项下混合对照品溶液，经0.45 ?m微孔滤膜过滤，按“2.3”项下色谱条件，分别取2、4、6、8、10、12、14 μL进样，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：丹参素Y=71.995X-1.657 1，r2=0.999 8;咖啡酸Y=128.09X-5.028 6，r2=0.999 9;迷迭香酸Y=137.56X-15.657，r2=0.999 8。结果表明，丹参素、咖啡酸、迷迭香酸分别在0.62～4.34 μg、0.48～3.36 μg、0.40～2.80 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
　　2.5  精密度试验
　　 取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件，连续进樣6次，测定峰面积，计算丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的RSD分别为0.34%、0.27%、0.48%，表明仪器精密度良好。
　　2.6  稳定性试验
　　 取“2.2”项下煎煮25、40 min的夏枯草供试品溶液，稀释3倍，按“2.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、14 h进样测定，计算丹参素、咖啡酸、迷迭香酸峰面积的RSD为0.73%、0.94%、1.45%，表明供试品溶液在14 h内稳定性良好。
　　2.7  重复性试验
　　 取“2.2”项下煎煮25、40 min的夏枯草供试品溶液各6份，按“2.3”项下色谱条件，进样测定，计算丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量。结果在25 min时，丹参素、咖啡酸含量最高;在40 min时，迷迭香酸的含量最高。取煎煮25 min的夏枯草供试品溶液12份、煎煮40 min的夏枯草供试品溶液6份，分别稀释3倍，使其峰面积在线性范围内，计算得丹参素、咖啡酸、迷迭香酸RSD分别为1.83%、1.67%、0.88%，表明方法重复性良好。
　　2.8  加样回收率试验
　　 取“2.2”项下煎煮25 min时已知丹参素含量为0.665 mg/g、咖啡酸含量为0.423 mg/g，煎煮40 min时已知迷迭香酸含量为0.599 mg/g的夏枯草浓缩浸膏（夏枯草煎液过滤后置于旋转蒸发仪上60 ℃减压浓缩）各6份，分别加入相当于样品中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量100%的对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，结果丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的平均回收率分别为100.28%、98.53%、100.30%，RSD分别为2.08%、1.81%、1.09%，见表2。
　　2.9  样品含量测定
　　 分别取25、30、35、40、45、50 min不同煎煮时间的夏枯草供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，按回归方程计算丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量，结果见表3，含量变化趋势见图2。 　　3  讨论
　　 本研究结果表明，在线性范围内，夏枯草中迷迭香酸的含量在煎煮时间为40 min时最高，且变化较为明显;在线性范围内，丹参素、咖啡酸的含量在煎煮25 min时含量最高，咖啡酸在煎煮25 min后的变化较小，这2种成分在煎煮25 min以内的含量变化还需进一步研究。
　　 结合本课题前期研究考察不同煎煮时间发现，采用电磁炉加热，随着时间延长，水分蒸发较多，导致煎煮液较少，甚至完全蒸发，故试验结果误差较大;在进行对比后，采用电热套加热回流，使方法进一步完善，增加了结果的可靠性。
　　 本试验先后考察了以乙腈-0.05%、0.2%磷酸水溶液为流动相，洗脱梯度，以及25、30 ℃柱温设置，结果发现采用0.1%磷酸水溶液、柱温为20 ℃时，更有利于丹参素、咖啡酸、迷迭香酸3种成分的分离。
　　 本研究考察了不同煎煮时间夏枯草中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的含量变化，结果表明，在煎煮25 min后丹参素的含量变化明显，可能与其不稳定有关;咖啡酸的含量变化趋于稳定。提示随着煎煮时间变化，药物各组分之间可能发生复杂的化学反应，影响中药某些成分的含量[15]。本试验可为确定夏枯草的最佳煎煮时间及其质量控制和临床应用提供一定参考。
　　参考文献：
　　[1] 李咏梅，肖冰梅.夏枯草的药用研究概述[J].中国医药指南，2013， 11（19）：479-480.
　　[2] 徐丽静，王颖.丹参素抗肿瘤作用机制的研究进展[J].浙江中医杂志， 2016，51（9）：700-701.
　　[3] 李骅，王四旺，张邦乐，等.丹参素的药理活性和药物动力学研究进展[J].亚太传统医药，2010，6（2）：110-112.
　　[4] 牟艳铃，于人江，解砚英，等.咖啡酸对阿糖胞苷致小鼠白细胞、血小板减少及血小板体积变化的预防和治疗作用[J].中国临床药理学与治疗学，2008，13（5）：508-511.
　　[5] PRASAD N R， JEYANTHIMALA K， RAMACHANDRAN S. Caffeic acid modulates ultraviolet radiation-B induced oxidative damage in human blood lymphocytes[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology，2009，95（3）：196-203.
　　[6] 杨九凌，祝晓玲，李成文，等.咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙酯药理作用研究进展[J].中国药学杂志，2013，48（8）：577-582.
　　[7] 杨叶，李磊.咖啡酸及其衍生物抗肿瘤作用分子机制研究进展[J].食品科学，2013，34（19）：341-345.
　　[8] SONG H S， PARK T W， SOHN U D， et al. The effect of caffeic acid on wound healing in skin-incised mice[J]. The Korean Journal of Physiology and Pharmacology，2008，12（6）：343-347.
　　[9] 孫皓熠，郝宝燕，张浩超，等.咖啡酸研究概况[J].食品与药品，2017， 19（2）：151-154.
　　[10] ANDRADE J M， FAUSTINO C， GARCIA C. Rosmarinus officinalis L.：an update review of its phytochemistry and biological activity[J]. Future Science OA，2018，4（4）：283.
　　[11] TAI J， CHEUNG S， WU M， et al. Antiproliferation effect of rosemary （Rosmarinus officinalis） on human ovarian cancer cells in vitro[J]. Phytomedicine，2012，19（5）：436-443.
　　[12] DORRIE J， SAPALA K， ZUNINO S J. Carnosol-induced apoptosis and downregulation of Bcl-2 in B-lineage leukemia cells[J]. Cancer Lett，2001，170（1）：33-39.
　　[13] TSAI C W， LIN C， WANG Y， et al. Carnosic acid induces the NAD（P）H：Quinone oxidoreductase 1 expression in rat clone 9 cells through the p38/nuclear factor erythroid-2 related factor 2 pathway[J]. Journal of Nutrition，2011，141（12）：2119-2125.
　　[14] BARNI M V， CARLINI M J， CAFFERATA E G， et al. Carnosic acid inhibits the proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells[J]. Oncol，2012，27（4）：1041-1048.
　　[15] 郭允，张家成，彭智平.煎煮时间对中药汤剂质量影响[J].成都中医药大学学报，2013，36（2）：24-25.
　　（收稿日期：2019-03-28）
　　（修回日期：2019-04-20;编辑：陈静）
　　基金项目：云南省科技计划[2017FF117（-008）]
　　通讯作者：范源，E-mail：1647909799@qq.com
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15182253.htm