通络外洗液有效成分二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定

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　　[摘要]目的 探讨通络外洗液中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定方法，以控制制剂的内在质量。方法 采用高效液相色谱法（HPLC）测定通络外洗液中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量，色谱洗脱柱为Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（58∶42）;流速：1 ml/min;检测波长：330 nm;柱温：35℃;进样量：5 μl。结果 二氢欧山芹醇当归酸酯在44.45～889.00 μg/ml范围内具有良好的线性关系（r=0.9998）;精密度、重复性、稳定性试验结果的相对标准偏差（RSD）均<2.00%，二氢欧山芹醇当归酸酯的回收率平均值为98.50%（RSD=1.79%，n=6），通络外洗液制剂中的二氢欧山芹醇当归酸酯含量不得低于0.20 mg/ml。结论 采用HPLC测定通络外洗液有效成分二氢欧山芹醇当归酸酯的含量取得良好的质量测评效果。
　　[关键词]通络外洗液;二氢欧山芹醇当归酸酯;高效液相色谱法;含量测定
　　[中图分类号] R284          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）3（a）-0032-04
　　Determination of the content of dihydroparsley angelic acid ester as an active ingredient in Tongluo External Lotion
　　ZHANG Yan-xia   LUO Yu   LI Xue-ming   ZHANG Yuan-hua
　　Department of Pharmacy， Shaoguan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province， Shaoguan   512026， China
　　[Abstract] Objective To study a method for the determination of dihydroparsin angelic acid ester in Tongluo External Lotion， so as to control the intrinsic quality of the preparation. Methods The content of dihydroparsin angelic acid ester in the washing solution was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The chromatographic elution column was Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）; mobile phase： acetonitrile-water （58∶42）; flow rate： 1 ml per minute; detection wavelength： 330 nm; column temperature： 35℃; injection amount： 5 μl. Results Dihydroparsin angelic acid ester had a good linear relationship in the range of 44.45-889.00 μg/ml （r=0.9998）. The relative standard deviation （RSD） of precision， repeatability and stability test results were all <2.00%， the average recovery rate of dihydroparsin angelic acid ester as angelic acid ester was 98.50% （RSD=1.79%， n=6）， and the content of dihydroparsin angelic acid ester in the Tongluo External Lotion preparation should not be less than 0.20 mg/ml. Conclusion HPLC is used to determine the content of dihydroparsin as an active ingredient in Tongluo External Lotion.
　　[Key words] Tongluo External Lotion; Dihydroparsin angelic acid ester; High performance liquid chromatography; Content determination
　　通絡外洗液为我院骨科专家研制的用于骨折、扭挫伤、风湿性关节肿胀疼痛等的纯中药制剂，并已取得医院制剂批文（粤ZB20110531）。该制剂由独活、香加皮、艾叶、桂枝、花椒根、钩藤、鸡血藤、豆豉姜共8味中药组成，具有活血通络、消肿止痹痛的功效，经临床广泛应用，收到满意的疗效，且使用简便、药源丰富、安全性高，已深受患者的欢迎。在此之前，该制剂的质量控制仅限于对独活的薄层定性鉴别和微生物检测，无有效成分的含量测定项目。为使通络外洗液的质量标准可控性更强，更好地发挥其临床疗效，本研究以独活所含的主要成分之一二氢欧山芹醇当归酸酯为测定指标，采用高效液相色谱法（HPLC）对其进行含量测定研究，为提高通络外洗液的质量标准提供实验依据。关于HPLC测定中成药中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量鲜有报道，本文在参考中国药典及相关文献的基础上，进行系列的色谱条件试验，现报道如下。 　　1仪器与试药
　　1.1仪器与试剂
　　KQ5200DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏仪器有限公司）; Agilent1100，Sartorius SQP型（日本岛津）;十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，max 60 g，d 0.01 mg）;乙腈、甲醇（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）;本研究所用试剂均为分析纯;水为自制蒸馏水。
　　1.2试药
　　通络外洗液（本院制剂室提供，批号：20190512、20190513、20190514，每包250 ml）;独活阴性对照样品（本院制剂室提供，批号：20190512、20190513、20190514，每包250 ml）;二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（上海鸿永生物科技有限公司，批号：050006-201811，HPLC≥98%）。
　　2方法与结果
　　2.1通络外洗液的制备
　　取60份处方中的8味药材，称取总重量，置煎煮提取器中加入药材总重的12倍水，充分浸泡（夏季提前2 h浸泡，冬季需浸泡过夜），加热煎煮提取2次，头煎2 h，二次煎1.5 h，合并两次煎液，常压浓缩至30 000 ml，相对密度不低于1.01（25℃），分装，即得。
　　2.2 制剂的性状
　　本品为棕黑色液体，气微香。
　　2.3二氢欧芹当归酸酯的含量测定
　　2.3.1 HPLC色谱条件
　　色谱柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（58∶42）;流速：1.0 ml/min;检测波长：330 nm;柱温：35℃;进样量：5 μl。理论塔板数按二氢欧山芹醇当归酸酯≥6000。
　　2.3.2溶液的制备
　　2.3.2.1标准品溶液的制备  精密称取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品8.89 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解后，稀释至刻度，定容、摇匀，配成浓度为0.889 mg/ml的二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液。
　　2.3.2.2供试品溶液的制备  精密量取通络制剂50 ml，加入95%乙醇60 ml静置沉淀48 h，抽取上清液，置水浴锅80℃烘干，残渣加甲醇使溶解，转移至25 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。
　　2.3.2.3阴性空白对照溶液  精密量取按处方比例及制备工艺制备不含独活的阴性制剂50 ml，按照供试品溶液的制备方法制成阴性空白对照溶液，备用。
　　2.3.3线性关系考察
　　分别精密量取“2.3.2.1”项下对照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，分别进样5 μl，注入液相色谱仪，依照上述色谱条件，测定其峰面积积分值。以进样量（μg/ml）为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，绘制标准曲线并进行回归分析。计算回归方程为Y =12.432X+25.854，R2=0.9999。结果显示，二氢欧山芹醇当归酸酯在44.45～889.00 μg/ml范围内线性关系良好（图1）。
　　2.3.4系统适应性试验
　　分别将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各5 μl，按“2.3.1”项下的色谱条件，注入HPLC检测仪，依法测定，并记录色谱图。结果显示，供试品溶液色谱中与二氢欧山芹醇当归酸酯相对应的保留时间处（T=18.075）有明显的吸收峰，且呈现出与相邻其他成分较理想的色譜分离度（R>1.5），而阴性空白对照液在二氢欧山芹醇当归酸酯相应保留时间处无色谱峰出现，提示阴性样品不存在干扰。色谱图见图2～4。
　　2.3.5稳定性试验
　　精密吸取同一供试品溶液（批号：20190512）5 μl，每隔一段时间进样1次，测得样品溶液在24 h内的稳定性，记录色谱峰面积的RSD为1.03%。结果显示，供试品溶液在24 h内稳定性良好（表1）。
　　2.3.6重复性试验
　　取同一批次制剂供试品（批号：20190513），按上述供试品溶液的制备方法平行制备5份供实验用的样液，分别精密吸取5 μl，依法注入液相色谱仪，测定二氢欧山芹醇当归酸酯的含量，平均含量为0.261 mg/ml，计算RSD为1.96%，提示制剂的含量测定方法的重复性良好（表2）。
　　2.3.7精密度试验
　　精密吸取同一对照品溶液5 μl，连续依法进样操作5次，记录峰面积的RSD为0.20%，提示精密度良好（表3）。
　　2.4.7加样回收率试验
　　精密量取已知含量的同一批次供试品（批号：20190513，含量为0.258 mg/ml）25 ml，平行做6个，分别精密加入2.2084 mg/ml的二氢欧山芹醇当归酸酯对照品3 ml，按“1.3.2”项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取各加样回收供试品溶液5 μl，注入液相色谱仪测定含量，试验结果见表4。
　　2.4.8样品含量测定
　　取3批样品（批号：20190512、20190513、20190514），按供试品溶液的制备条件测定，每次进样5 μl，计算含量及RSD值，测定结果见表5。
　　经上述3批平均含量测定结果，在其平均含量的基础上下浮20%，因此，暂定通络外洗液制剂中的二氢欧山芹醇当归酸酯含量不得低于0.20 mg/ml。
　　3讨论
　　通络外洗液属于我院的院内制剂，在临床多年使用至今，疗效确切，原先的质量控制仅限于物理鉴别和独活的薄层定性鉴别，而HPLC测定有效成分的含量是最能有效控制制剂的内在质量，同时也是制剂稳定性研究的基础。独活作为通络外洗方中的君药，具有祛风通痹止痛的功效，在临床疗效中发挥关键作用。二氢欧山芹醇当归酸酯为独活中的主要成分之一，本研究选取独活中的有效成分二氢欧山芹醇当归酸酯建立含量测定方法，并进行了方法学考察，旨在为提高通络外洗液的质量标准，使制剂的定量鉴别具有一定的代表性。 　　本研究建立的含量测定方法是在参考中药药典[1]及相关文献[2-15]的基础上，经过反复试验筛选出理想的、便于操作的、适合通络外洗液供试品检测的色谱系统条件，结果显示，色谱峰峰形、分离度、理论塔板数符合相关要求;试验方法简便可行、灵敏度高、专属性强、稳定性良好、重现性、加样回收率高，阴性空白对照无干扰，可有效控制通络外洗液的内在质量。
　　中药组方成分复杂，研究和提高制剂的质量标准一直是中药质量分析研究领域的重大课题，本研究在通络外洗液原标准的基础上增加了独活中有效成分二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定，而进一步的研究需对通络外洗液处方中的指标成分筛选考察，进行多指标控制，以建立更加完善的质量标准，同时也为我院院内制剂的内在质量标准的控制提供思路。
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　　（收稿日期：2019-05-31  本文编辑：闫  佩）
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