超高液相色谱法测定盐肤木中8种成分含量
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作者:李鸷 叶淼 华怡静 叶永华 许文 徐伟 郑海音
摘要：目的 建立超高效液相色谱法同时测定盐肤木中8种成分含量方法，为盐肤木药材的质量控制提供依据。方法 采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），流动相为乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，检测波长275 nm。结果 没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷的线性范围分别为23.31～1165.5 ng（r=0.999 2）、27.02～1351.5 ng（r=0.999 1）、6.30～315.0 ng（r=0.999 2）、12.36～618.0 ng（r=0.999 2）、17.14～857.5 ng（r=0.999 6）、9.24～461.5 ng（r=0.999 8）、25.29～1264.5 ng（r=0.999 6）和6.18～309.0 ng（r=0.999 3），平均加样回收率为96.77%～99.41%（RSD为2.23%～3.24%）。盐肤木样品经聚类分析和主成分分析可分为两类，且没食子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯和漆黄素等成分在两类中的分布存在差异。结论 本研究建立的方法可为完善盐肤木药材的质量标准和加强质量控制提供依据。
关键词：盐肤木;超高效液相色谱法;含量测定;没食子酸;苔黑酚葡萄糖苷;没食子酸甲酯;3，5-二羟基甲苯;鞣花酸;漆黄素;五没食子酰葡萄糖;根皮苷
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）01-0073-07
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201901002
Simultaneous Content Determination of Eight Compositions in Rhus Chinensis Mill. by UPLC
LI Zhi1， YE Miao1， HUA Yijing1， YE Yonghua1， XU Wen1， XU Wei1， ZHENG Haiyin2
1. School of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Centre of Biomedical Research & Development， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China; 2. College of Integrative Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China
Abstract： Objective To establish a UPLC method to simultaneously determine the contents of eight chemical compositions in the root of Rhus chinensis Mill.; To provide references for quality control of Rhus chinensis Mill. Methods The UPLC method was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18 column （2.1 mm × 100 mm， 1.7 ?m） with a gradient elution using acetonitrile and 0.1% formic acid. The flow rate was 0.3 mL/min; the column temperature was 35 ℃; the detection wavelength was set at 275 nm. Results Gallic acid， orcinol glucoside， methyl gallate， 3，5-dihydroxytoluene， ellagic acid， fisetin， pentagalloylglucose and phlorizin showed good linear relationship within the range of 23.31–1165.5 ng （r=0.999 2）， 27.02–1351.5 ng （r=0.999 1）， 6.30–315.0 ng （r=0.999 2）， 12.36–618.0 ng （r=0.999 2）， 17.14–857.5 ng （r=0.999 6）， 9.24–461.5 ng （r=0.999 8）， 25.29–1264.5 ng （r=0.999 6）， and 6.18–309.0 ng （r=0.999 3）， respectively. The overall recoveries were ranged from 96.77% to 99.41% with the RSD range of 2.23%–3.24%. After cluster analysis and principal components analysis， the collected samples of Rhus chinensis Mill. could be divided into two types of patterns， and there are differences in the distribution of compositions in the two types， such as gallic acid， pentagalloylglucose， methyl gallate and fisetin. Conclusion The method can provide a basis for improving the quality standard and quality control of Rhus chinensis Mill. Keywords： Rhus chinensis Mill.; UPLC; content determination; gallic acid; orcinol glucoside; methyl gallate; 3，5-dihydroxytoluene; ellagic acid; fisetin; pentagalloylglucos; phlorizin
鹽肤木Rhus chinensis Mill.又称五倍子树、五倍柴等，属漆树科盐肤木属的落叶灌木或乔木，主要分布于福建、广东、广西等地，其主要入药部位为根和茎，有活血化瘀、行血止痛功效，用于治疗冠心病、心绞痛、胸闷、憋气等[1]。现代研究表明，盐肤木具有改善微循环和心脑缺血、抗血小板凝集、降脂、抗炎、抗人类免疫缺陷病毒等活性，其研究和应用潜力很大[2-4]。目前仅《福建省中药材标准》[5]和《广东省中药材标准》[6]收载盐肤木，而国内外文献对盐肤木药材质量控制的报道很少。有报道以没食子酸含量为指标对盐肤木的复方及单味药制剂进行含量测定研究[7-8];朱俊彦等[9]采用HPLC测定盐肤木药材中的没食子酸含量;叶永华等[10]采用福林酚法，以没食子酸为对照品，测定闽产盐肤木根茎中总酚酸含量。但是仅检测没食子酸或总酚酸含量难以全面评价和控制盐肤木的质量。
超高效液相色谱（UPLC）具有更高的分离度和灵敏度，目前越来越广泛用于中药分析[11-14]。本课题组前期针对盐肤木开展了化学成分研究，分离了盐肤木中8种主要成分（没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷）[15]。本研究建立UPLC同时测定盐肤木根中8种成分含量的方法，为该药材指标性成分的选择、质量标准提升和全面质量控制提供参考。
1 仪器与试药
安捷伦LC1290超高效液相色谱仪（安捷伦公司），CPA225D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司），KQ-500E台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FY135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。
对照品没食子酸（批号110831-201204，中国食品药品检定研究院）、苔黑酚葡萄糖苷（批号110885- 200102，中国食品药品检定研究院）、没食子酸甲酯（批号G1202055，上海阿拉丁试剂有限公司）、3，5二羟基甲苯（批号MUST-15092512，成都曼思特生物科技有限公司）、鞣花酸（批号MUST-16062603，成都曼思特生物科技有限公司）、漆黄素（批号MUST- 16060513，成都曼思特生物科技有限公司）、五没食子酰葡萄糖（批号13102821，上海同田生物技术股份有限公司）、根皮苷（批号MUST-14110409，成都曼思特生物科技有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯（德国MERCK公司），其余试剂均为分析纯。
17批盐肤木样品分别购自饮片公司或采自不同产地，来源信息见表1。经福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为漆树科盐肤木Rhus chinensis Mill.的干燥根，样本存放于福建中医药大学生物医药研发中心标本室。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）;流动相：乙腈（B）-0.1%甲酸水（A），梯度洗脱（0～10 min，2%～4%B;10～16 min，4%～10%B;16～25 min，10%～12%B;25～35 min，12%～12%B;35～36 min，12%～15%B;36～44 min，15%～16%B;44～49 min，16%～50%B;49～49.1 min 50%～2%B;49.1～53 min，2%～2%B）;流速：0.3 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：5 μL;检测波长：275 nm。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液
取没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷对照品适量，精密称定，加入50%甲醇，分别制成浓度为1.01、1.05、0.985、0.988、0.995、1.01、1.02、1.12 mg/mL的单一对照品贮备液。取单一对照品贮备液适量，制成没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷浓度分别为233.1、270.3、63.0、123.6、171.5、92.3、252.9、61.8 μg/mL的混合对照品溶液，并以50%甲醇稀释，得系列浓度混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液
盐肤木样品粉碎，过60目筛。取干燥样品粉末0.5 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性试验
分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷8种化合物与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5000。色谱图见图1。
2.3.2 线性关系考察
将“2.2.1”项下不同浓度混合对照品溶液依次注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析并记录8个成分的峰面积，分别以各成分峰面积（Y）对各化合物浓度（X）作线性回归，求线性方程及相关系数，结果见表2。 2.3.3 精密度试验
取混合对照品溶液适量，1 d内按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷8个成分的峰面积，计算其峰面积RSD分别为1.21%、0.85%、0.94%、1.54%、0.63%、1.28%、0.96%、0.91%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
取同一批次（S12）盐肤木样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件于0、1、2、4、8、12、24 h分别进样5 μL，记录没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖、根皮苷8个成分的峰面积，计算其RSD分别为1.03%、1.46%、1.86%、1.33%、0.95%、1.95%、1.68%、1.35%，表明样品稳定性良好。
2.3.5 重复性试验
精密称取S12样品0.5 g，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别记录每份样品的8个成分的峰面积，并计算各个成分的含量分别为6.454、5.438、0.2125、1.017、0.6488、0.1385、2.872、0.9380 mg/g，含量RSD分别为2.31%、1.98%、1.61%、2.53%、2.32%、2.08%、2.05%、2.44%，表明本方法的重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验
精密称取S12样品0.25 g，平行6份，按近似1∶0.5、1∶1、1∶1.5分别加入各对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算各成分回收率和RSD，结果见表3～表10，表明本方法回收率良好，符合分析要求。
2.4 样品含量测定
分别精密称取不同批次盐肤木样品粉末0.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，根据标准曲线计算8种成分含量，结果见表11。
2.5 样品含量聚类分析和主成分分析
运用DPS14.50数据处理软件，采用系统聚类法，以8种成分的质量分数为变量，数据转换方式为主成分转换，聚类距离为欧式距离，聚类方法为离差平方和法，对17批盐肤木样品进行聚类分析，结果见图2。可以看出，当欧式距离介于3.10～5.75时，17批样品得以良好的区分，其中S8～S10、S12～S14和S17共7个批次聚类为Ⅰ类，而余下的10个批次（S1～S7、S11和S15～S16）聚为Ⅱ类。从聚类表型上看，盐肤木药材存在2种含量类型，进一步用GraphPad Prism 7软件对这两类（Ⅰ类和Ⅱ类）盐肤木样品进行含量统计分析，2种类型样品中8个成分含量的箱型圖见图3。
为研究各成分的贡献率大小，进一步采用DPS14.50统计软件对盐肤木样品中8个成分的含量进行主成分分析，结果见图4。可以看出，17批样品的投影可分为两类，且投影区分的类型与聚类分析结果一致。取特征值>1且特征值统计检验显著性水平P<0.05的主成分，得线性回归方程：Y=0.399 5X1-0.324 3X2-0.196 9X3-0.334 6X4-0.134 2X5-0.641 7X6+0.175 0X7+0.352 2X8，式中X1～X8分别对应没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷8种成分。其中，第1主成分为没食子酸，贡献率为43.05%。
3 讨论
在样品前处理中，本研究考察了不同的提取方法（回流、超声、索氏提取），结果表明超声提取和回流提取效果较佳，且两者无明显差异，故最终采用超声提取。进一步考察不同提取溶剂（不同浓度甲醇、乙腈）、溶剂倍量、提取次数、提取时间对样品中8种成分提取的影响，最终优化为50倍量甲醇，超声30 min，提取1次。
在色谱柱选择上，通过HPLC预试验发现苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5-二羟基甲苯这3种成分的色谱峰常互相叠加，且漆黄素和五没食子酰葡萄糖峰也常未能分开，甚至漆黄素峰完全包裹于五没食子酰葡萄糖峰内，保留时间重合，因此改用UPLC进行分离，并针对这几种难以分离的成分，比较了CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Uitimate UHPLC AQ-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Syncronis aQ（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）4种超高效液相色谱柱对盐肤木中8种成分的分离效果，最终采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流速优化为0.3 mL/min。流动相系统的优化选择先后比较了4种流动相系统（乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水，甲醇-0.1%甲酸水，甲醇-水），结果表明，在乙腈-0.1%甲酸水溶剂系统下，尤其针对漆黄素和五没食子酰葡萄糖2种成分，可通过延长色谱时间使其基线分离，最终使8种分析物分离度均达到最佳。另外，对于波长的选择，经过DAD光谱扫描，8种待测成分在波长275 nm处均有最大或明显吸收，故选择检测波长为275 nm。
盐肤木富含酚酸类成分，没食子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、鞣花酸等成分具有显著的抗氧化、抗炎和神经保护作用[16-18];黄酮类成分漆黄素具有抗过氧化氢诱导的神经保护作用[19];查尔酮类成分根皮苷可以改善血脂、血糖内环境[20]，对内分泌代谢诱导的冠心病可能有良好作用;酚苷类成分苔黑酚葡萄糖苷及其苷元3，5-二羟基甲苯具有良好的抗氧化和调节神经系统的作用[21-22]。本研究选择的8种指标成分均具有与盐肤木功效类似的活性。17批不同产地盐肤木样品中8种成分含量测定结果表明，没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷及五没食子酰葡萄糖含量较高，均值分别达4.123、4.301、1.965 mg/g，没食子酸甲酯、鞣花酸和根皮苷含量均大于0.5 mg/g;而3，5-二羟基甲苯、漆黄素则含量相对较低。本研究的盐肤木样品除来自市购外，主要采集了地方药材标准收载盐肤木的福建省和广东省的野生样品，从8种成分总量来看，野生样品中含量最高者分别为福建龙岩野生S17（25.26 mg/g）、福建福安野生S9（18.54 mg/g）、广东清远野生S8（13.74 mg/g），而福建福安野生S9、广东清远野生S8、广东汕头野生S7、广东广州野生S4和福建泉州野生S3含量均达到10 mg/g以上，提示这些地区的盐肤木可能具有更好的开发利用价值。17批样品通过聚类分析和主成分分析，经模式识别发现可聚成两类，其中S8～S10、S12～S14和S17聚为Ⅰ类，其余10批聚为Ⅱ类。根据福建省和广东省药材标准，盐肤木全年可采收，本研究野生样品为不同月份收集，聚类中存在2种类型的交叉;另外，来自福建和广东的野生样品在聚类中存在交叉，市售和野生样品在聚类中也存在交叉。考虑模式聚类的成因可能与野生、采收时间、产地等有关，有待进一步研究。 通过箱型图比较两类样品中8种成分含量分布情况，可以看出类别Ⅰ的没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、五没食子酰葡萄糖、漆黄素含量总体箱型分布均高于类别Ⅱ，其中没食子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、漆黄素含量差异有统计学意义。盐肤木为复方满山白、舒冠通糖浆等中成药的重要原料，模式分类结果可为中药企业识别盐肤木来源提供基础，也可为药材规范化种植资源的选择提供参考依据。本研究结果提示不同来源盐肤木的品质可能存在较大差异，因此建议盐肤木的多成分质量评价体系综合表征其药理活性成分，进行整体质控。
综上，本试验建立了UPLC同时测定盐肤木没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸甲酯、3，5二羟基甲苯、鞣花酸、漆黄素、五没食子酰葡萄糖和根皮苷8种成分含量方法，该方法简便准确，重复性好，可为盐肤木药材质量控制提供参考依据。
致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室、福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。
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（收稿日期：2019-01-01）
（修回日期：2019-01-21;编辑：陈静）
基金项目：国家自然科学基金青年基金（81803678）;福建省科技厅引导性项目（2016Y0057）;福建省高校产学合作项目（2016Y4007）
通讯作者：徐伟，E-mail：xwfjtcm@sina.com;郑海音，E-mail：zhyfjtcm@sina.com
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