巨峰葡萄组织培养快繁技术研究
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摘要：采用巨峰葡萄腋芽茎段进行组织培养繁育技术试验。结果表明，无菌腋芽茎段诱导丛生芽较适宜的培养基组成为1/2MS+0.03～1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA，较适宜的根分化培养基组成为1/2MS+0.1mg/LIAA，组培的环境条件是温度22～25℃、每日光照14小时和光照强度1800～2000Lx。
关键词：巨峰葡萄；腋芽茎段；组织培养
中图分类号：S663.1 文献标识码：A 文章编号：1002-2910(2011)02-0006-03
葡萄(Vitis vinifera Linn.)为葡萄科(Vitace-ae)葡萄属(Vitis Linn)多年生藤本植物，世界栽培面积达1000万hm2，占世界水果产量的30％以上。仅次于柑桔居第二位。葡萄除了鲜食外，可用于酿酒、制干和制汁等，还可作为食品工业原料，又是美化庭园楼阁、绿化荒山碱滩的观赏和绿化树种。
生产上葡萄苗木通常采用枝条扦插法繁育，笔者利用组织培养法将腋芽茎段培育成为试管苗和植株。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料与消毒
将通过休眠期的巨峰葡萄枝条插入沙床中催芽，待新梢长出3节以上时，剪取嫩枝，除去幼叶，剪成1.0～1.5cm长的茎段，每段带有腋芽或顶芽，作为组培外植体。
取材时用75％的酒精棉球擦洗剪刀，对盛放嫩枝的器械消毒，减少细菌污染。用自来水冲洗茎段2～3小时后，放在无菌水中，置于冰箱内，温度4℃左右处理4小时，取出，用自来水加0.02％的洗洁精浸泡10分钟，摇动，洗净材料表面的菌物。将材料转入干净的三角瓶中，加入75％的酒精，浸泡杀菌20秒钟，再用蒸馏水漂洗一次，转入经过高压消毒的三角瓶中，加入0.1％的升汞溶液，浸泡杀菌8分钟，摇动三角瓶，使升汞与材料充分接触，取出用蒸馏水冲洗4～6次，每次1～2分钟，除去残留的升汞。
1.2 接种方法与丛生芽的诱导
芽分化培养基的配制，以1/2MS为基本培养基，即用MS的大量元素的一半，再附加0.03～0.10mg/LNAA和0.5～1.0mg/L6-BA，配制6种培养基(表1)，用1.0mol/L的NaOH调节pH值至5.8，加热到80℃时加入琼脂粉4.0g/L，煮沸后分装于100ml的三角瓶中制成培养基，用膜封口，在高压锅中高压灭菌25分钟后备用。
茎段消毒后，放在消毒滤纸上吸干水分，于茎段原下切面之上0.5cm左右处切一新切面，使之成为0.5cm左右的小段，每段要有芽，分别接种于6种芽分化培养基上。根据叶芽茎段在不同培养基上诱导丛生芽情况，筛选出适宜的诱导芽分化培养基和外植体，在温度22-25％、每日光照14小时、光照强度1800～2000Lx条件下培养诱导不定芽。
1.3 丛生芽根分化的诱导
设置生根培养基3种。丛生芽长1.0～1.5cm时切取丛生芽，接种在3种诱导根分化的1/2MS培养基上(表2)，每三角瓶培养基上接种3～5个，用膜封口，培养条件同诱导丛生芽条件。
1.4 试管苗的移栽
在三角瓶根分化培养基上已生根的葡萄小植株，揭去瓶口封膜在培养室中炼苗7～10天，茎杆逐渐变红，叶片油亮并形成保护组织，部分苗梢部伸出瓶口。将此组培小苗取出，洗净根部附着的培养基，移栽到灭过菌的蛭石和珍珠岩(1:1)的基质中，浇透水，用塑料薄膜盖好，在膜上打些小孔，利于通气，置于温室中，一周后逐渐揭去塑料膜，二周后植株开始长出新叶，根开始伸长且长出新根。将组培苗连同基质一起移入盆中或苗圃中。
2 结果与分析
2.1 丛生芽诱导效果
腋芽茎段在芽分化培养基上培养15天，产生绿色不定芽，再经一周时间长成丛生芽，不同培养基的诱导效果见表3。6种芽分化培养基对葡萄腋芽茎段发生不定芽的诱导率75％～100％，不定芽发生数量以D和E两种芽分化培养基(1/2MS+0.03mg/L NAA+1.0mg/L6-BA和1/2MS+0.05mg/LNAA+1.0mg/L6-BA培养基)诱导出的为多，分别是8个和6个。但不定芽的生长情况以F培养基(1/2MS+0.10 mg/LNAA+1.0mg/L6-BA培养基)较好。
2.2 根的诱导效果
切取的丛生芽接种在根分化培养基上，经过10天的培养，在单芽茎段基部产生愈伤组织，随后分化出了幼根，如表4。S1、S2和S3三种培养基中，以S2根分化培养基(1/2MS+0.1 mg/L IAA培养基)诱导出根效果最好，诱导率达到100％，平均生根条数4.7条。S1(1/2MS+0.1 mg/L IAA+0.05 mg/L NAA)和s3(1/2MS+0.05 mg/L NAA)培养基的诱导率分别为64％和71％，平均生根条数分别为2.5条和3.0条。
2.3 无菌植株的建立
茎段带菌是建立无菌系的障碍。当叶芽茎段经过75％酒精杀菌20秒、0.1％的升汞溶液杀菌8分钟后，未能彻底解决茎段带菌问题，接种于培养基第4天，在茎段周围可见菌落，而远离茎段的培养基上未见霉菌菌落，污染多发生在茎段处。接种于培养基第6天，在超净工作台上，将未染菌的茎段转移，最终建立了无菌植株。
2.4 试管苗的移栽
葡萄试管苗叶片薄，组织结构疏松，气孔突起，开口大，根系活力低，是移栽于基质中困难的主要原因。光培炼苗改善苗质是移栽成活的关键，掌握好移栽过程中的细节，移栽成活率能达到90％以上。3结论与讨论
研究结果表明，巨峰葡萄无菌腋芽茎段诱导丛生芽较适宜的培养基组成为1/2MS+0.03～1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA，腋芽茎段不定芽发生快，数量多。较适宜的根分化培养基组成为1/2MS+0.1mg/LIAA，根系发达，健壮。腋芽茎段组培诱导丛生芽和根的环境条件是温度22～25℃、每日光照14小时、光照强度1800～2000Lx。培养建立无菌植株，需对腋芽茎段进行严格杀菌消毒。发现带菌茎段，及时将未污染的茎段转移。组培苗由三角瓶培养基上移栽于基质中前，需经光锻炼健壮后进行。
试验中发现0.1％的升汞浸泡8分钟，时间稍长些，对茎段有一定程度的毒害作用，影响了茎段腋芽萌发，可以进行减少升汞消毒的时间试验，减轻对茎段的毒害影响。对不定芽继代培养中的繁殖系数，繁殖周期以及诱导生根的周期，移栽到大田后根系的发育情况等需进一步研究。
通过葡萄叶芽茎段诱导丛生芽的途径获得了再生完整小植株，为葡萄苗木的快速繁育提供了可能途径。
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