黄花柳3个无性系叶色及叶绿素荧光特性比较

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　　摘要 [目的]了解黄花柳资源的变异特性。[方法]以黄花柳3个无性系为材料，通过柯尼卡CR-400全自动色差计对其叶色参数进行测定，通过乙醇提取方法对其叶绿素含量进行测定，使用Pocket PEA快速荧光仪对其叶绿素荧光特性进行分析比较。[结果]叶绿素含量与L、a均呈显著负相关；金枝黄花柳的叶色偏黄、叶绿素含量较低，但其潜在光化学活性最强，对强光胁迫具有较强的自我保护能力；普通黄花柳叶色偏绿、叶绿素含量较高，其潜在光化学活性也较强，但其对光能的利用率最低；红枝黄花柳的叶色较金枝黄花柳偏绿，较普通黄花柳偏黄，其叶绿素含量与光能利用率均介于二者之间。[结论]叶绿素含量越高叶片颜色越偏绿色且越明亮；金枝黄柳较其他2个黄花柳无性系叶片颜色更鲜艳，且其光化学活性最强，对光能的利用率最大。
　　关键词 黄花柳；叶色参数；叶绿素；叶绿素荧光特性
　　中图分类号 S718.46 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0118-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.035
　　Abstract [Objective]To know about the variation characteristics of the resources of Salix caprea.[Method]We used three clones of S. caprea as experimental materials，determined its leaf color parameters by Konica CR400 and its chlorophyll content by ethanol extraction method. The fluorescence characteristics of the chlorophyll were analyzed and compared using the Pocket PEA fast fluorometer.[Result]The chlorophyll content was negatively correlated with Lvalue and avalue. S. caprea ‘GoldenStem’ had yellow color leaves and lower chlorophyll content， but its photochemical activity was the strongest， so it had strong selfprotection ability against strong light stress.For common S.aprea，it’s leaf color was greenish， the chlorophyll content was higher， and its potential photochemical activity was stronger.The color of S. caprea ‘RedenStem’ was greenish compared with the S.aprea‘GoldenStem’， the chlorophyll content and utilization of light energy were between the two clones.[Conclusion]The higher the chlorophyll content， the more green and bright the leaves are. The color of S.aprea ‘GoldenStem’ is more vivid than the other two clones， and S.aprea‘GoldenStem’ had strongest photochemical activity and maximum utilization of light energy.
　　Key words Salix caprea；Leaf color parameters；Chlorophyll；Chlorophyll fluorescence characteristics
　　柳樹是杨柳科（Salicaceae）柳属（Salix）植物的统称，柳属植物分布广泛，种类繁多，目前已知全世界有520种，我国有257种[1]，122变种，大多是灌木。柳树在我国是重要的阔叶树种，是游憩林、防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要组成树种，具有很高的生态、经济、美学价值[2-4]。黄花柳（Salix caprea）为其中一种，为灌木或小乔木，枝条黄绿色至紫红色，叶片卵状长圆形、宽卵形至倒卵状长圆形，雄花花序阔椭圆形，花药黄色，具有很高的观赏价值。柳树长期生长在自然条件下，受周围环境及种间或属间杂交的影响很容易发生变异，具有丰富的遗传多样性[5]，通过黄花柳的一些生理指标可以了解到其变异特征，但在以往的关于柳树的研究中很少有对不同表现型黄花柳进行研究的。笔者选择黄花柳3个表现型的无性系为材料，对黄花柳3个无性系叶色参数、叶绿素含量以及叶绿素荧光特性进行分析比较，以期了解黄花柳资源的变异特性，为优良品种的选育工作提供帮助。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　试验地为河北农业大学林学苗圃。以来自河北省张家口小五台山自然保护区的3个黄花柳无性系（金枝黄花柳、红枝黄花柳、普通黄花柳）2年生扦插苗为材料，进行叶色、叶绿素含量、叶绿素荧光特性的测定及比较。
　　1.2 方法
　　1.2.1
　　叶片色差参数的测定。叶片色差的测定方法参照刘晶芳等[6]，使用柯尼卡CR-400全自动色差计分别测定3个黄花柳无性系健康枝条上中部（第6或7位）成熟健康的叶片，每种黄花柳随机选取3个健康的枝条作为3个重复。使用色差计测定其L、a、b值，其中，L值表示叶片亮度，L值越高则叶片的亮度越大；a值表示红/绿，a值为正值时其值越大则叶片越偏红，其值为负值时绝对值越大则叶片越偏绿；b值表示黄/蓝，b值为正值时其值越大则叶片越偏黄，其值为负值时绝对值越大则叶片越偏蓝。 　　1.2.2
　　叶绿素含量的测定。分别摘取普通黄花柳、金枝黄花柳、红枝黄花柳的中部叶片带回实验室，用清水洗去表面尘土，用吸水纸吸干表面水分，将叶片剪碎混合，分别称取叶片0.2 g于10 mL离心管中，加入10 mL 95%乙醇，每种黄花柳3个重复，黑暗处理浸提48 h，用分光光度计分别测定其在663、645 nm下的吸光值，计算叶绿素a和叶绿素b的含量。
　　1.2.3 叶绿素荧光参数的测定。于10：00左右在苗圃地选取3个黄花柳无性系中部的成熟健康叶片暗处理20 min，使用Pocket PEA快速荧光仪，分别测定3个黄花柳无性系中部叶片的初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm），然后按照公式Fv=Fm-Fo计算出可变荧光Fv进而得到PSⅡ的原初光化学效率（Fv/Fm）以及PSⅡ的潜在光化学活性（Fv/Fo）。用PAM-2500便携式荧光仪分别测定3个黄花柳无性系中部叶片的光化学淬灭系数（qP）以及非光化学淬灭系数（NPQ）。
　　1.3 数据处理与分析
　　使用Excel和DPS软件对测定数据进行分析和图形绘制，采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）及相关性分析研究不同品种间各个指标的变异情况及不同指标之间相关性大小，运用Duncan’s比较法进行平均值间差异显著性检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 黄花柳3个无性系叶色的比较
　　L值表示叶片光泽程度，a值表示叶片的红/绿，b值表示叶片的黄/蓝。从图1可以看出，金枝黄花柳的L值为52.82，普通黄花柳和红枝黄花柳的L值分别为46.53和45.46，金枝黄花柳的L值显著高于普通黄花柳和红枝黄花柳，而普通黄花柳与红枝黄花柳的L值无显著差异，说明相同位置下金枝黄花柳叶片比普通黄花柳和红枝黄花柳的叶片明亮，普通黄花柳与红枝黄花柳叶片光泽程度相近；3个无性系黄花柳叶片的a值均为负值，金枝黄花柳的a值为-7.00，普通黄花柳与红枝黄花柳的a值分别为-13.98和-14.34，金枝黄花柳的a值显著高于其他2个无性系，说明相同位置下3个无性系的叶色均呈现绿色，而金枝黄花柳的叶色呈现的绿色较浅，其他2个无性系的叶色更偏向深绿色；黄花柳3个无性系叶片的b值均为正值，且三者之间均存在显著差异，以金枝黄花柳最大为25.72，红枝黄花柳最小为20.96，说明3个黄花柳无性系的叶片均偏黄，以金枝黄花柳的叶片偏黄程度最大。就金枝黄花柳而言，3个值与其他2个无性系差异均极显著，而其他2个无性系3个值之间并无显著差异，一定程度上难以区分。
　　2.2 黄花柳3个无性系叶绿素含量的比较
　　叶绿素是绿色植物光合作用的重要结构体，其含量的多少是衡量植物光合作用的重要指标[7]。从图2可以看出，黄花柳3个无性系的叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总含量均存在显著差异，以普通黄花柳的叶绿素含量最高，其叶绿素a、叶绿素b及叶绿素（a+b）含量分别为1.33、0.44和1.77 mg/g。金枝黄花柳最低，其叶绿素a、叶绿素b及叶绿素（a+b）含量分别为1.02、0.37和1.39 mg/g。说明在正常生长环境下，普通黄花柳的叶片对于光能的吸收能力较其他2个无性系强。对于叶绿素b的吸收能力三者并无显著差异。3个黄花柳无性系的叶绿素a含量均是叶绿素b的2倍以上，说明正处于生长期的黄花柳光合作用大于呼吸作用，处于有机物的积累阶段。
　　2.3 叶绿素含量与叶色参数的相关分析
　　由表1可以看出，叶色参数a、b值与L值呈极显著正相关，说明叶片的光亮程度受叶片颜色的影響极大。叶绿素含量与叶色参数（L值、a值）之间均存在显著负相关，叶绿素a、叶绿素（a+b）与叶色参数a值之间存在极显著负相关，叶绿素b与叶色参数a值之间存在显著负相关，说明叶绿素含量越高叶片呈现的颜色越偏绿色且叶片明亮有光泽，而叶绿素含量与叶色参数b值无显著相关性，说明叶绿素含量与叶片黄蓝色无明显的相关性。
　　2.4 黄花柳3个无性系叶绿素荧光特性的比较
　　Fv/Fo通常被用来度量PSⅡ的潜在光化学活性；Fv/Fm反映PSⅡ反应中心的光能转化效率。在非逆境条件下，不同种类或生态型维管植物叶片的光能转化效率Fv/Fm通常有固定的表现，均在0.832左右[8]。由表2可以看出， Fv/Fo和Fv/Fm 均以普通黄花柳最高（Fv/Fo为3.97，Fv/Fm为0.80），红枝黄花柳最低（Fv/Fo为3.58，Fv/Fm为0.77），普通黄花柳和金枝黄花柳之间的差异不显著，可见普通黄花柳的光能转化效率最高。淬灭系数包括光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ），qP是PSⅡ激发能捕获效率的体现，在一定程度上反映了PSⅡ反应中心的开放程度[9]，NPQ反映PSⅡ天线色素所吸收的光能没有被用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的那部分光能，NPQ越高则植物的热耗散能力越强，即植物对于强光胁迫下光合机构的保护能力越强，反之越差[10]。从表2可以看出，红枝黄花柳的NPQ最大为0.58，普通黄花柳最小为0.33。普通黄花柳的qP显著高于金枝黄花柳但与红枝黄花柳无显著差异。可见红枝黄花柳的PSⅡ反应中心的开放程度较高，普通黄花柳的热耗散能力较强。
　　将绿色植物或含有叶绿素的部分组织进行暗适应后，突然暴露在可见光下，植物绿色组织会发出暗红色，强度随时间不断变化的荧光信号，以荧光信号做出的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。快速叶绿素荧光诱导动力学曲线指的就是从O点到P点的荧光变化过程[11-12]。典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线呈现O、J、I、P相，O相为刚暴露在光下时的最低荧光，此时 PSⅡ反应中心处于“完全开放”状态；O-J相是QA被还原成QA-的过程，故J相（2 ms）反映了QA-的大量积累；J-P相是QB接受QA-的电子的过程，但这个过程分为2部分，J-I相是电子传递过程中快还原性PQ库先被完全还原的过程，I-P相是慢还原型PQ库被还原的过程，P相为荧光的最高峰，QA和QB是2个重要的光合电子传递体，决定着电子传递的效率[13-14]。 　　图3为3个黄花柳无性系的荧光动力学（OJIP）曲线。从图中可以看出，3个黄花柳无性系的OJIP曲线变化趋势基本一致，在O相（20 μs）至J相（2 ms）之间普通黄花柳和红枝黄花柳的差异不明显，但均显著高于金枝黄花柳，说明普通黄花柳和红枝黄花柳的受体侧的电子传递效率低于金枝黄花柳；在J相至I相之间普通黄花柳和红枝黄花柳之间的差异开始变大；在I相（30 ms）黄花柳3个无性系的差异更加明显，普通黄花柳和红枝黄花柳的差异变大；在I-P相，3个黄花柳无性系中，普通黄花柳荧光强度>红枝黄花柳荧光强度>金枝黄花柳荧光强度，说明PSⅡ中PQ库的还原能力从大到小依次为金枝黄花柳、红枝黄花柳、普通黄花柳。
　　3 结论与讨论
　　（1）通过对黄花柳3个无性系叶色参数的比较，发现金枝黄花柳较其他2个无性系的叶片颜色偏黄绿且叶片更有光泽，红枝黄花柳较普通黄花柳的叶色偏黄，但明亮程度均相近，普通黄花柳的叶色为绿色。
　　（2）通过对叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总含量的比较分析，发现黄花柳3个无性系叶片的叶绿素a、叶绿素b含量以及叶绿素总含量的高低表现一致，均依次为普通黄花柳、红枝黄花柳、普通黄花柳。
　　（3）通过叶色参数与叶绿素含量的相关性分析，发现叶绿素a、叶绿素b均与叶色参数a值呈显著负相关，与b值呈不显著性负相关，即叶绿素a和叶绿素b含量越高叶色呈现的绿色越明显，该研究结果与郭欢欢等[15]对叶绿素含量与叶片颜色的研究结果一致。通常认为，植物叶片中的叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色但不稳定易分解[16-17]。此次试验并不能说明叶绿素a和叶绿素b是呈现蓝绿色还是黄绿色，可能是由于叶绿素a和叶绿素b所呈现的蓝绿色和黄绿色中绿色更为明显，此次试验用到的仪器不能更加精确地体现黄蓝度也是其中一个原因。
　　（4）利用叶绿素荧光参数及动力学曲线探测黄花柳3个无性系的光反应过程，结果显示，Fv/Fo和Fv/Fm 均表现为普通黄花柳显著高于红枝黄花柳，金枝黄花柳与其他2个无性系均无显著差异，说明原初潜在光化学活性最高的是普通黄花柳；普通黄花柳的qP最高，而红枝黄花柳的NPQ最大，说明普通黄花柳的热耗散能力强，但在强光胁迫下具有较强保护能力的是红枝黄花柳。在叶绿素荧光动力学（OJIP）曲线中金枝黄花柳显著低于其他2个黄花柳无性系，说明金枝黄花柳叶片的PSⅡ反应中心所捕获的能量中用于电子传递的比例最高，一定程度上反映了金枝黄花柳叶片的反应活性最高，对光能的利用率最高。
　　综上所述，通过对黄花柳3个无性系的叶色、叶绿素荧光特性进行分析比较，发现叶绿素含量越高叶片颜色越偏绿色且越明亮；金枝黄花柳较其他2个黄花柳无性系叶片颜色更鲜艳，且其潜在光化学活性最强。黄花柳3个无性系的差异显著的原因有很多，环境压力对植物形态变异有较大影响[18]，因此，3个无性系之间的差异可能是受环境影响而产生的变异，但也有可能是源自自身的变异，还需要分子鉴定来进一步深入研究确认产生变异的原因。
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