益气化痰通络法对大鼠肺纤维化的作用及其机制

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　　[摘要]目的通過检测博来霉素诱导的肺纤维化大鼠血清转化生长因子`-β1（TGF`-β1）、基质金属蛋白酶2（MMP`-2）及窖蛋白1（Cav`-1）的表达，探讨益气化痰通络法的抗纤维化作用及其机制。方法将大鼠随机分为正常组（n=15）和造模组（n=90），造模组造模成功后随机分为NaCl组、中药煎剂组、泼尼松组、乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组、吡啡尼酮组，各15例。各组分别于造模成功后第15、30、45天处死大鼠，苏木精`-伊红（HE）染色观察肺组织纤维化程度，ELISA法检测肺组织中的羟脯氨酸、血清TGF`-β1和MMP`-2含量，RT`-PCR方法检测肺组织Cav`-1 mRNA表达，Western Blot方法检测肺组织Cav`-1蛋白表达。结果同一时间点各造模组与正常组相比，大鼠肺纤维化程度加重，肺组织羟脯氨酸含量、血清TGF`-β1和MMP`-2含量均升高（F=978.25～224 007.50，P<0.05）;并且随着时间进展逐渐升高，差异有统计学意义（F=21.55～9 624.52，P<0.05）;中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较，肺纤维化程度明显减轻，肺组织中的羟脯氨酸及血清TGF`-β1和MMP`-2含量均减少（F=324.55～5 576.36，P<0.05）;中药煎剂组与泼尼松组、吡啡尼酮组各时间点肺组织的羟脯氨酸及血清TGF`-β1和MMP`-2含量比较，差异无显著性（P>0.05）。与正常组相比，各造模组大鼠Cav`-1 mRNA及蛋白含量均显著降低（F=13.50～270.11，P<0.05）;并且随着时间进展逐渐降低，差异有统计学意义（F=11.25～23.43，P<0.05）;中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较，Cav`-1 mRNA及蛋白含量升高（F=5.26～154.13，P<0.05）;中药煎剂组与泼尼松组、吡啡尼酮组相比Cav`-1 mRNA及蛋白含量差异无显著性（P>0.05）。结论益气化痰通络法可能通过下调TGF`-β1和MMP`-2、上调肺组织Cav`-1的表达抑制博莱霉素诱导的肺纤维化。
　　[关键词]益气化痰通络法;肺纤维化;转化生长因子β1;基质金属蛋白酶2
　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the anti`-fibrotic effect of Qi`-tonifying， phlegm`-eliminating， and collateral`-dredging prescription and its mechanism by determining the serum expression of transforming growth factor beta`-1 （TGF`-β1）， matrix me`-talloproteinase 2 （MMP`-2）， and caveolin`-1 （Cav`-1） in a rat model of bleomycin`-induced pulmonary fibrosis. MethodsThe rats were randomly divided into normal group （n=15） and model group （n=90）. After successful modeling， the model group was randomly subdivided into NaCl group， traditional Chinese medicine （TCM） decoction group， prednisone group， acetylcysteine group， roxithromycin group， and pirfenidone group， with 15 rats in each group. Rats in each group were sacrificed on days 15， 30， and 45， and were observed for degree of pulmonary fibrosis of the lung tissue after hematoxylin`-eosin staining. ELISA was used to determine the content of hydroxyproline in the lung tissue and serum content of TGF`-β1 and MMP`-2; RT`-PCR and Western blot were used to determine the expression of Cav`-1 mRNA and Cav`-1 protein in the lung tissue， respectively. ResultsCompared with the normal group at the same time point， each model group had significantly increased degree of pulmonary fibrosis and elevated content of hydroxyproline in the lung tissue and serum content of TGF`-β1 and MMP`-2 （F=978.25-224 007.50， all P<0.05）， which gradually increased over time with significant differences observed （F=21.55-9 624.52， all P<0.05）， while each model group had significantly reduced content of Cav`-1 mRNA and protein （F=13.50-270.11， all P<0.05）， which gradually decreased over time with significant differences observed （F=11.25-23.43， all P<0.05）. Compared with the acetylcysteine group and the roxithromycin group， the TCM decoction group had significantly lowered degree of pulmonary fibrosis and decreased content of hydroxyproline in the lung tissue and serum content of TGF`-β1 and MMP`-2 （F=324.55-5 576.36， all P<0.05）， but had significantly increased content of Cav`-1 mRNA and protein （F=5.26-154.13， all P<0.05）. Compared with the prednisone group and the pirfenidone group at each time point， the TCM decoction showed no significant differences in content of hydroxyproline， serum TGF`-β1 and MMP`-2， or Cav`-1 mRNA and protein （all P>0.05）. ConclusionQi`-tonifying， phlegm`-eliminating， and collateral`-dredgingprescription may inhibit bleomycin`-induced pulmonary fibrosis bydown`-regulating TGF`-β1 and MMP`-2 and up`-regulating the expression of Cav`-1 in the lung tissue. 　　[KEY WORDS]invigorating Qi， resolving phlegm and activating collaterals; pulmonary fibrosis; transforming growth factor beta1; matrix metalloproteinase 2
　　肺纤维化是一种慢性、致命的肺间质疾病。它可以由多种原因引起，包括慢性炎症过程、感染、系统性自身免疫性疾病、环境因素、电离辐射暴露或某些药物等。病因不明的肺纤维化被称为特发性肺纤维化（IPF），与肺功能逐渐丧失有关[1`-2]。IPF的危险因素包括年龄、男性、接触金属和木屑以及吸烟史等[3`-4]。目前没有有效的IPF治疗药物，病人2.5～3.5年内死于呼吸衰竭。肺移植是提高IPF病人生存率的唯一有效措施[5`-6]。然而，IPF病人肺移植术后5年生存率仅为44%[4]。因此，寻找有效的药物治疗IPF迫在眉睫。肺纤维化在中医被称为“肺痿”、“短气”等，没有与之确切相对应的名词[7]。益气化痰通络法的中药制剂主要由黄芪、白术、半夏、川芎、丹参组成。有研究证实，益气化痰通络法的中药制剂有抗纤维化的作用，然而关于其抗纤维化机制尚不明确。本实验通过构建博来霉素诱导的肺纤维化模型，探讨益气化痰通络法对肺纤维化的作用及其机制，寻找肺纤维化的有效治疗药物。
　　1材料和方法
　　1.1实验材料
　　Wistar大鼠105只（雄性），体质量为（200±25）g，由青岛白鼠养殖合作社提供。博莱霉素（日本化药株式会社）;益气化痰通络法中药制剂：黄芪15 g，白术10 g，川芎10 g，丹参20 g，半夏10 g，制成水煎剂150 mL（北京同仁堂青岛药店）;泼尼松粉末、乙酰半胱氨酸、罗红霉素（上海源叶生物科技有限公司）;吡非尼酮（北京康蒂尼药业）;大鼠转化生长因子`-β1（TGF`-β1）、基质金属蛋白酶2（MMP`-2）ELISA检测试剂盒（美国RD System公司）;窖蛋白1（Cav`-1）一抗（bioworld公司）。离心机（Eppendorf，型号Centrifuge 5415D）;酶标仪（biotek 808）;显微镜（OLYMPUS，型号CX 31）;荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，型号ABI 7500）;多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cyberne`-tics公司，Image`-Pro Plus）。
　　1.2肺纤维化模型制备
　　应用100 g/L水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠（3.5 mL/kg），麻醉成功后，仰卧位固定，常规消毒颈部皮肤，沿颈部正中线切开颈部皮肤，分离颈部肌肉组织并暴露气管，将博来霉素溶液（5 mg/kg，溶于0.2 mL的生理盐水中）慢慢注入气管内，大鼠迅速直立并旋转，使两肺均匀分布博来霉素溶液，缝合切口。正常组注入等量的生理盐水。
　　1.3实验分组及处理
　　将大鼠随机分为正常组（A组，n=15）和造模组（n=90），造模組造模成功后随机分为NaCl组（B组）、中药煎剂组（C组）、泼尼松组（D组）、乙酰半胱氨酸组（E组）、罗红霉素组（F组）、吡啡尼酮组（G组），各15只。造模成功第2天，NaCl组给予9 g/L氯化钠溶液灌胃，每日2次，每次2 mL;中药煎剂组给予益气化痰通络法中药制剂灌胃，每日1次，每次5 mL;泼尼松组给予泼尼松灌胃，每日1次，每次5 mL;乙酰半胱氨酸组给予乙酰半胱氨酸灌胃，每日3次，每次2 mL;罗红霉素组给予罗红霉素灌胃，每日1次，每次5 mL;吡啡尼酮组给予吡啡尼酮灌胃，每日1次，每次5 mL。正常组给予正常鼠粮。
　　1.4检测指标及方法
　　1.4.1标本采集各组分别于造模成功第15、30及45天灌胃后处死大鼠，每次5只。剪取肺组织;腹主动脉采血并离心，置于-20 ℃冰箱保存。
　　1.4.2肺组织苏木精`-伊红（HE）染色和纤维化程度评分将新鲜肺组织用40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脱水，透明，浸蜡、包埋，连续切片，脱蜡，HE染色，显微镜下观察。根据Ashcroft评分量表[8]，对大鼠肺组织纤维化程度进行评分。
　　1.4.3肺组织中羟脯氨酸及血清中TGF`-β1、MMP`-2含量检测采用ELISA方法。
　　1.4.4Cav`-1 mRNA和蛋白表达检测采用RT`-PCR方法检测Cav`-1 mRNA的表达，Westren Blot方法检测Cav`-1蛋白表达。
　　1.5统计学处理
　　应用SPSS Statisics 21.0软件进行统计学处理，计量资料结果以±s形式表示，数据比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1各组肺组织纤维化程度及评分比较
　　高倍镜下（100倍）观察，正常组肺组织肺泡结构完整，肺泡间隔未见水肿、增宽;造模组肺泡腔炎症细胞浸润明显，肺泡结构严重破坏，肺泡间隔明显增宽，大量成纤维细胞聚集在肺泡间隔，随着时间进展逐渐加重，第45天时最严重;与NaCl组相比，中药煎剂组、泼尼松组、吡啡尼酮组、乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组肺纤维化程度均显著减轻;中药煎剂组肺纤维化程度与吡啡尼酮组、泼尼松组比较未见明显差异，与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较肺纤维化程度明显减轻。
　　各组肺纤维化程度评分时间和组别有交互作用（F组别×时间=477.98，P<0.01）。同一时间段各组之间比较，造模组大鼠的肺纤维化程度评分均较相应时间段正常组显著升高，差异具有统计学意义（F=28 836～34 469.73，P<0.05）;并且随着时间进展，各组大鼠肺纤维化程度逐渐升高，差异有统计学意义（F=572.72～4 095.47，P<0.05）;泼尼松组、吡啡尼酮组与中药煎剂组纤维化评分比较，差异无显著性（P>0.05）;中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较，肺纤维化程度评分明显减轻，差异有统计学意义（F=1 043.12～2 105.34，P<0.05）。见表1。 　　2.2各组大鼠肺组织羟脯氨酸含量比较
　　各组大鼠肺组织羟脯氨酸含量时间和组别有交互作用（F组别×时间=53.36，P<0.05）。与正常组相比，各造模组大鼠各时间点肺组织羟脯氨酸含量显著升高（F=978.25～1 154.27，P<0.05）;并且随着时间进展含量逐渐升高，差异有统计学意义（F=21.55～123.03，P<0.05）。中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较，各时间点肺组织中的羟脯氨酸减少（F=324.55～548.71，P<0.05）。见表2。
　　2.3各组大鼠血清TGF`-β1、MMP`-2含量比较
　　各组大鼠血清TGF`-β1、MMP`-2含量时间和组别均有交互作用（F组别×时间=4 867.88、33.23，P<0.05）。与正常组相比较，各造模组大鼠各时间点TGF`-β1含量显著升高（F=168 042.20～224 007.50，P<0.05）;并且随着时间进展逐渐升高，差异有统计学意义（F=3 683.90～9 624.52，P<0.05）;中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较，TGF`-β1含量减少（F=4 312.51～5 576.36，P<0.05）;中药煎剂组与泼尼松组、吡啡尼酮组比较，各时间点TGF`-β1含量差异无显著性（P>0.05）。与正常组相比较，各造模组大鼠MMP`-2含量显著升高（F=2 342.69～4 195.06，P<0.05）;并且随着时间进展逐渐升高，差异有统计学意义（F=61.93～946.56，P<0.05）;各时间点中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组相比较，MMP`-2的含量均减少（F=248.62～348.55，P<0.05）;中药煎剂组与泼尼松组、吡啡尼酮组比较MMP`-2含量差异无显著意义（P>0.05）。见表3、4。
　　2.4各组大鼠肺组织Cav`-1 mRNA及蛋白表达比较
　　各组大鼠肺组织Cav`-1 mRNA及蛋白表达时
　　2期李晓丹，等. 益气化痰通络法对大鼠肺纤维化的作用及其机制233
　　间和组别有交互作用（F组别×时间=2.58、4.67，P<0.05）。同一时间与正常组相比较，各造模组大鼠Cav`-1 mRNA及蛋白含量显著降低（F=13.50～270.11，P<0.05）;并且随着时间进展逐渐降低，差异有统计学意义（F=11.25～23.43，P<0.05）;中药煎剂组与乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组比较，Cav`-1 mRNA及蛋白含量升高（F=5.26～154.13，P<0.05）;中药煎剂组与泼尼松组、吡啡尼酮组相比Cav`-1 mRNA及蛋白含量均未见明显的变化（P>0.05）。见图1和表5、6。
　　3讨论
　　IPF是一种慢性、进行性、不明原因的间质性肺疾病。IPF的预后非常差，病人的平均生存期只有3～5年[9]。遗传易感性、慢性损伤和衰老、氧化应激和再生反应受损等因素可能是疾病发展和持续的原因[10`-11]。IPF的主要特征是肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，细胞外基质（ECM）蛋白如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白过度沉积，导致气体交换减少和肺功能受损[12`-13]。肌成纤维细胞可能来源于以下几个方面：TGF`-β1刺激成纤维细胞活化，从而导致修复性纤维化反应，引起成纤维细胞局限增殖;骨髓来源的CD34+祖细胞迁移到纤维组织中，分化为肌成纤维细胞;上皮`-间充质转化（EMT）[14`-15]。中医认为，IPF是由气阴亏虚、痰热郁滞所致[18]。多项研究证实，中药可以治疗多种肺部疾病，黄芪主要有效成分是皂苷、甲苷和黄酮类化合物，白术为白术根茎，黄芪、白术配伍主治营卫不固，用以驱邪后巩固体内正气;丹参、当归益气补血，祛瘀止痛，凉血消痈;半夏具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效。因此，本研究探討了益气化痰通络法对肺纤维化大鼠模型的作用及其机制。
　　本文实验采用气管内滴注博来霉素的方法构建肺纤维化大鼠模型[19]。选用罗红霉素、泼尼松、吡啡尼酮作为中药煎剂的对照，是因为吡啡尼酮能抑制肺泡上皮细胞损伤引起的巨噬细胞的活化，抑制中性粒细胞、单核细胞等聚集、活化，减少促纤维化因子如TGF`-β、TNF`-α、NF`-κB等的释放，抑制成纤维细胞增殖、转化，进而抑制肺纤维化[20`-22]。IPF发生的机制之一是氧化/抗氧化失衡，罗红霉素与糖皮质激素具有相似的抗炎机制，具有抑制中性粒细胞的迁移、聚集和黏附作用，进而抑制炎症反应。罗红霉素和糖皮质激素还能抑制细胞因子分泌，减少气道上皮细胞内皮素的表达[23]。因此，罗红霉素通过与糖皮质激素相似的类激素样免疫调节作用，抑制肺纤维化进展。
　　本文研究结果显示，与正常组比较，造模组大鼠肺组织炎症细胞浸润明显，肺泡间隔增宽，肺泡结构破坏，大量成纤维细胞聚集在肺泡间隔，第45天纤维化程度最重。胶原蛋白是结缔组织中胶原纤维的主要组成部分，在人体蛋白质中含量最高，羟脯氨酸是胶原沉积的有效指标，羟脯氨酸含量可以反映组织的胶原代谢、纤维化程度。本文研究结果显示，NaCl组各时间点羟脯氨酸含量均明显增加，HE染色出现明显肺纤维化，说明博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型建立成功;中药煎剂组、泼尼松组、吡啡尼酮组、罗红霉素组纤维化程度减轻，肺纤维化评分、羟脯氨酸含量均较相同时间的NaCl组显著减轻，说明中药煎剂、泼尼松、吡啡尼酮、罗红霉素能够降低羟脯氨酸含量，减轻肺纤维化程度。吡啡尼酮组、泼尼松组、中药煎剂组比较，肺纤维化程度、肺纤维化评分、羟脯氨酸含量未见明显差异，说明吡啡尼酮、泼尼松、中药煎剂均能改善肺纤维化，中药煎剂改善肺纤维化程度较吡啡尼酮、泼尼松无明显差异;中药煎剂组肺纤维化评分、羟脯氨酸含量较乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组明显减轻，说明中药煎剂改善肺纤维化程度明显优于乙酰半胱氨酸、罗红霉素。 　　TGF`-β1是参与肺纤维化发病机制的主要细胞因子，TGF`-β1信号通路通过诱导细胞分化、迁移、浸润或增生性改变参与肺纤维化发展[24`-25]。TGF`-β1由多种细胞分泌，包括肺泡上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞[26]，TGF`-β1与受体结合后，启动下游Smad信号通路介导的信号转导，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，诱导EMT，增强胶原蛋白的沉积并抑制其降解，促进疾病的进展[27`-28]。同时，TGF`-β1活化后进一步促进炎症因子和促纤维化因子的表达，进一步促进肺纤维化进展。基质金属蛋白酶（MMPs）在肺纤维化的发病过程中起着极为重要的作用，其主要作用为降解基膜和胶原蛋白[29`-30]。MMP`-2通过降解基膜的蛋白质，破坏上皮基膜后导致间质细胞渗出肺泡腔，从而引起肺纤维化的发生发展。
　　胞膜窖是细胞质膜上的一种内陷结构，而Cav`-1是组成胞膜窖的重要结构蛋白。有研究发现，在系统性硬化症（SSc）病人肺成纤维细胞中发现较低水平的Cav`-1，并且与JNK、ERK和Akt信号通路的活化相关，导致促纤维化标志物如胶原蛋白和α`-SMA过表达。对皮肤成纤维细胞研究显示，SSc皮肤中Cav`-1蛋白表达下调，可能通过激活经典转化生长因子（TGF`-β）途径促进胶原沉积的增加，表明Cav`-1是人真皮成纤维细胞中TGF`-β表达和信号传导的正调节因子[30]。本文结果显示，活性纤维化区域Cav`-1的表达显著降低，并且TGF`-β1对Cav`-1有负调节作用。
　　本研究结果显示，中药煎剂组、泼尼松组、吡啡尼酮组、罗红霉素组TGF`-β1、MMP`-2均较相同时间的NaCl组显著降低，Cav`-1 mRNA和蛋白表达明显增加，说明中药煎剂、泼尼松、吡啡尼酮、抗生素通过降低TGF`-β1、MMP`-2含量，促进Cav`-1的表达以减轻肺纤维化。本文结果还显示，吡啡尼酮組、泼尼松组与中药煎剂组比较，TGF`-β1、MMP`-2含量及Cav`-1 mRNA和蛋白表达未见明显差异，说明三者减少TGF`-β1、MMP`-2含量，促进Cav`-1 mRNA和蛋白表达的作用无明显差异;中药煎剂组TGF`-β1、MMP`-2含量较乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组明显降低，而Cav`-1 mRNA和蛋白含量明显升高，说明中药煎剂对TGF`-β1、MMP`-2表达的抑制作用及对Cav`-1 mRNA和蛋白表达促进作用明显优于乙酰半胱氨酸、罗红霉素。
　　综上所述，益气化痰通络法中药制剂能够抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，其作用可能是通过抑制TGF`-β1、MMP`-2表达，促进Cav`-1表达实现的。益气化痰通络法中药制剂对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的干预效果显著优于罗红霉素和乙酰半胱氨酸，与糖皮质激素、吡啡尼酮比较无明显差异，但是中药具有副作用和禁忌证较少的优点，为肺纤维化的治疗提供了新的方法。
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