蛋白质组学在慢性乙型肝炎常见中医证型中的研究

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　　摘要：蛋白质组学逐渐成为系统性认知疾病的一种重要方法，该方法从整体角度分析不同状态下细胞内的动态变化，与中医的整体观一致，在研究中医证候中显示出独特优势，并在认识多种疾病的中医证候上取得进展。目前蛋白质组学在研究慢性乙型肝炎发病机制及预后上取得一定成果，在慢性乙型肝炎常见中医证型差异上也取得进展。本文主要对蛋白质组学在慢性乙型肝炎常见中医证型中的研究做一综述。
　　关键词：蛋白质组学;慢性乙型肝炎;中医证型
　　中图分类号：R259                                    文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.009
　　文章编号：1006-1959（2019）20-0030-04
　　Study on Proteomics in Common TCM Syndromes of Chronic Hepatitis B
　　ZHOU Teng-teng1，ZHENG Ying2，LIANG Hui-qing2，TANG Jin-mo2
　　Abstract：Proteomics has gradually become an important method for systemic cognitive diseases. This method analyzes the dynamic changes in cells under different conditions from a holistic perspective. It is consistent with the overall view of TCM and shows unique advantages in the study of TCM syndromes. And made progress in understanding TCM syndromes of various diseases. At present， proteomics has made progress in studying the pathogenesis and prognosis of chronic hepatitis B， and has made progress in the differences in common TCM syndrome types of chronic hepatitis B. This article reviews the research of proteomics in common TCM syndromes of chronic hepatitis B.
　　Key words：Proteomics; Chronic hepatitis B; TCM syndromes
　　慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是指机体感染乙型肝炎病毒后，可检测到乙肝病毒阳性的传染性肝病。CHB呈世界性流行，但各个地区的流行性差异很大，我国是乙肝大国，2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查显示，我国1～59岁一般人群乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带率为7.18%，经推算，我国乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者约9300万人，其中CHB患者约2000万人[1]。持续性的病毒感染会导致肝脏损害，肝纤维化形成、肝硬化及肝癌的发生。隨着蛋白质组学技术的迅速发展，筛选出和疾病发生机制、临床诊断、治疗及预后相关的差异表达蛋白成为可能，蛋白质组学关于CHB的研究受到广泛关注。中医药在慢性乙型肝炎诊治中发挥着十分重要的作用，形成了慢性乙型肝炎辨证分型和治疗方案，明确了中医药治疗慢性乙型肝炎的优势环节[2]，多数学者通过蛋白质组学研究CHB中医证候，为诠释中医现代化内涵提供理论支持，本文主要对蛋白质组学这一新兴技术对CHB常见证型的研究作一综述。
　　1蛋白质组学
　　蛋白质是人体及各种生命物质的基本组成单位，已知的蛋白质有一百多万种，具有不同的组成、结构和修饰。在生理、病理状态下，机体的蛋白质组具有特定的表达，机体代谢物的蛋白质组发生变化，通过蛋白质组学技术，找到这些新产生的蛋白质（称为“上调”）或减少的蛋白质（称为“下调”），这些蛋白质叫做“差异蛋白”[3，4]。蛋白质组学以全面的蛋白质研究为基础，全方位对蛋白质水平的调节机理、功能联系等方面进行探索。蛋白质组学（proteome）最早由澳大利亚科学家Wilkins和William于1994年在Siena双向凝胶电泳会议上提出，于1995年7月发表在Electrophoresis杂志上，现在把它定义为“基因组表达的全部蛋白质”，它与基因组相对应，也是一个整体的概念[5]。蛋白质组学的研究层次涉及细胞、组织、器官、机体在一定状态或者一定时间内的蛋白质功能的具体表达，包括了蛋白的组成、分布、种类、蛋白质表达水平、翻译后修饰、蛋白间的互相作用，研究着眼于蛋白质的动态变化规律[6]。近年来蛋白质组学的技术进展为深入研究提供了契机，如常用的荧光差异双向凝胶电泳能在动态范围内对相应的蛋白质进行精确定量，固相pH梯度双向电泳体系可分析复杂蛋白质复合物，而双向高效液相色谱技术，其分离蛋白质的容量较荧光差异双向凝胶电泳大，且操作简单、速度快，通过与质谱结合，既可在常温下分离制备水溶性物质，又具有高温、高效、高分辨率和高灵敏度等特点。随着计算机软件分析的广泛运用，可在样品分离后，处理蛋白质表达的数据，寻找表达的差异点后切割酶解，并分析鉴定，确定其种类、组成和修饰，搜索蛋白质数据库，对比确定蛋白质的信息，蛋白质指纹图谱技术，是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台[7]。 　　2蛋白质组学与中医辨证论治
　　中医的“证”是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质的反映，“候”是病变的临床表现。证候实质的研究一直是中医药现代化研究的热点，研究认为中医证候之间的差异性具有特定的微观基础。近年来，基因组学、蛋白质组学、代谢组学的进展为中医证候学研究提供微观层次的理论支持，蛋白质组学是一种系统化的研究方法，它着眼于将研究对象作为一个完整的系统进行研究，且具有特定时间、特定状态下的特异性表达的特点，与中医证候的整体观、恒动观、辨证论治十分相似[8]。蛋白质组的动态变化与机体的动态演变具有一致性，能够在微观层次说明中医证候的差异，是实现微观辨证的重要技术，运用蛋白质组学技术可进一步说明中医同病异证及异病同证的理论基础，解释中医证型的物质基础，更深层次的了解变化规律，建立“证蛋白质表达谱”，理解中医证候的客观内涵，为中医辨证的客观化提供依据与方法[9，10]。
　　目前蛋白质组学在多种疾病的中医辨证论治中取得一定研究进展，其差异性表达能够为临床辨证论治提供依据，在心、肾、脑等重要脏器的疾病证候认识上已有广泛运用。胡小勤等[11]选择高血压病气虚血瘀证和肝阳上亢证患者各40例进行研究，发现差异蛋白有27个，其中有11个蛋白表达上调，16个蛋白表达下调。熊新贵等[12]通过对比10例健康人与13例高血压病肝阳上亢证患者的血清蛋白质组，用凝胶电泳技术检测出500个蛋白点，与健康组对比发现16个明显差异的蛋白点，肝阳上亢患者血清中血清铜蓝蛋白、甲基-天冬氨酸蛋白受体、维生素结合蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白等表达均上调，糖蛋白表达下调。王刚等[13]对冠心病心血瘀阻证和心肾阴虚证这两种证候之间差异进行研究，共发现10种差异表达蛋白，其中7种表达上调，3种表达下调。涉及的通路主要有补体和凝血级联通路及阿尔兹海默症信号通路。研究认为补体和凝血级联通路及阿尔兹海默症信号通路与冠心病心血瘀阻证和心肾阴虚证的中医分型有关。卢德赵[14]通过凝胶内差异显示电泳技术发现药物性肾阳虚能夠导致机体多种功能代谢紊乱，并从肝线粒体蛋白质组角度阐述肾阳虚与能量代谢的关系。蛋白质组学在一定程度上反映疾病不同证候间的生物学差异，检测差异蛋白仍是目前研究的热点。
　　3蛋白质组学与CHB
　　目前蛋白质组学在CHB的研究应用中涉及发病机制、疗效预测等方面。Liu F等[15]使用基于蛋白质组学的鉴定技术，将自发性HBsAg血清清除组和CHB患者组对照，发现血浆纤连蛋白可能与HBsAg血清清除有关，并可能成为“功能性治愈”的预测因子。Dai YN等[16]通过检查不同纤维化阶段CHB患者的蛋白质组学变化，来寻找肝纤维化S2期的血清生物标志物，结果发现139种差异蛋白，其中凝胶蛋白2（ficolin-2）和羧肽酶B2（carboxypeptidase B2）在患者和健康对照组间有明显差异，并可能参与CHB发病机制。Makjaroen J等[17]在CHB患者的临床试验中测试了干扰素λ（IFN-λ），其只存在于上皮细胞中，故副作用相比干扰素α（IFN-α）局限，其蛋白质组学数据表明干扰素λ3（IFN-λ3）抑制细胞中的HBV复制、降低HBV转录物和细胞内HBVDNA的水平。She S等[18]为了获得关于CHB发病机制的进一步信息，并寻找用于抗CHB治疗的新型推定分子，采用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技术来鉴定在HBV DNA转染的HepG2.2.15细胞系及其亲本HepG2细胞系中差异表达的分泌蛋白，总共检测到133种独特蛋白差异表达，其中ENPP2（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 precursor）是与HBV复制相关的上调最显著的分泌蛋白之一，该研究表明ENPP2可能是一种新的抗HBV靶标，抑制其表达可能抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。
　　4蛋白质组学与CHB中医证型
　　中医学中无CHB的病名，但从其发病特点及其临床表现来看，将其归属于“胁痛”“黄疸”“肝着”“瘟疫”“积聚”范畴，关于辨证分型的标准，2004年湖北宜昌标准中将CHB分为五个证型：肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、肝胆湿热证、脾肾阳虚证、瘀血阻络证，具体描述了每个证型的辨证要点，近十余年来，CHB的中医诊断标准无明显变化。2018年中华中医药学会肝胆病分会制定的《CHB中医诊疗指南》将CHB中医证型分为肝胆湿热证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、瘀血阻络证、脾肾阳虚证[19]。
　　现阶段，对CHB证候的差异蛋白研究正在逐渐系统化，蛋白质组学与中医证候的动态变化明显相关，发现标志性差异蛋白仍是目前的研究热点。周明德[20]运用iTRAQ技术筛选出CHB肝郁脾虚证与正常组的血清差异表达蛋白，共筛选出30个血清差异表达蛋白，其中22个上调，8个下调，运用蛋白质印迹法对选定的CHB肝郁脾虚证差异表达蛋白等进行验证，得出PSMA6（proteasome subunit alpha type-6）、PF4V（platelet factor 4 variant）作为CHB肝郁脾虚证的证候特异性表达蛋白较为可靠，PSMA6在治疗前与健康对照组比较表达趋势上调，研究发现PSMA6蛋白可能是CHB肝郁脾虚证疗效动态变化的预测标志物，对CHB肝郁脾虚证的早期诊断、治疗及预后的判断有重要意义。杨健坤[21]通过对比CHB肝郁脾虚证与脾胃湿热证，发现PF4V、PSMA6可作为可靠的肝郁脾虚证候特异表达蛋白，FETUA（alpha-HS-glycoproteine）、CATC（dipetidyl peptidase 1）、PLTP（Phospholipid transfer protein）则可作为CHB肝胆湿热证可靠的特异表达蛋白。杨利超[22]的研究显示，TUBAIA（tubulin alpha-1A chain）是CHB肝郁脾虚证的生物标志物，功能可能与酶活性调节代谢过程、脂质代谢、结合、催化活性、细胞发育、细胞转运、细胞凋亡、免疫应答有关系，ACTA2（actin，aortic smooth muscle）、ACTG2（actin，gamma-enteirc smooth muscle）、ZNF628（zinc ifnger protein 628）、DEFA1（neutrophil defensin 1）、DEFA3（Nneutrophil defensin3）、CaM（calmodulin）为湿热证的潜在标志物，可能与肌动蛋白、免疫反应、细胞杀伤、细胞凋亡、刺激反应、生物调节、结合、催化活性有关。Yang J等[23]采用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定30名肝郁脾虚证和30名肝胆湿热证患者的潜在血清蛋白生物标志物，在842个检测到的蛋白质中，分别有273和345个在患者与健康对照组间差异表达。两种证型共有142种上调蛋白和84种下调蛋白，其中几种蛋白已被报道为候选生物标志物，包括免疫球蛋白相关蛋白，补体成分，载脂蛋白，热休克蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白质和α-2-巨球蛋白。 　　陈文莉等[24]通过对差异蛋白质点进行质谱鉴定，共发现7个差异表达蛋白，主要包括免疫相关蛋白，炎症蛋白以及脂类代谢相关蛋白，验证了CHB肝郁脾虚证和湿热中阻证间存在多个差异表达蛋白，提示不同的蛋白质表达谱可能是同病异证的分子基础，各证型中免疫球蛋白J链（IGJ）表达均有升高，其中肝郁脾虚证IGJ表达量比湿热中阻证中的高，湿热中阻证中表达异常的蛋白质主要属于急性时相和脂类代谢有关的蛋白质，临床表现湿热越重，肝功能损害越重，故反应急性时相的蛋白质如C反应蛋白（CRP）、血清淀粉蛋白酶在湿热中阻中较正常人表达明显升高。载脂蛋白（APO-A1、APO-C2和APO-C3）在CHB各证型组与正常人对照组相比有明显下降，可能与肝细胞损伤后影响载脂蛋白生理合成有关。
　　蛋白质组学在证候差异上具有鲜明特点，分析证候间的差异蛋白与CHB免疫状态下的不同特点，可进一步与中医理论相结合，建立“证蛋白质表达谱”。冯培民[25]运用差异蛋白组学方法将CHB的肝胆湿热、肝郁脾虚、脾胃湿热证型与健康人对比，其中肝郁脾虚证与肝胆湿热证比较上调的蛋白有59个，下调的蛋白有64个，肝郁脾虚证与脾胃湿热证比较上调的蛋白有32个，下调的蛋白有188个，脾胃湿热证与肝胆湿热证比较上调的蛋白有189个，下调的蛋白有21个，各个组间差异蛋白表达情况不同，脾胃湿热证与肝胆湿热证在实验通路信息学分析中有显著差异的通路是hsa04145，与吞噬、细胞粘附作用有关，肝郁脾虚证与脾胃湿热证有显著差异的通路是hsa04514，与细胞粘附分子、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸有关，除此以外，各组与健康人对比，蛋白组成均有明显差异。郭芳宏[26]通过双向电泳技术分离CHB湿热中阻、肝郁脾虚和瘀血阻络三证型患者外周血总蛋白来建立相应蛋白质图谱，对比发现CHB患者的不同证型间存在同病异证的蛋白图谱区别，在湿热中阻证中差异表达的与炎症有关的急性时相CRP、结合珠蛋白升高，而肝郁脾虚证中蛋白谱差异表现在肝功能状况的前白蛋白表达较正常人降低，但较其他两种证型下降程度轻，提示肝郁脾虚证的肝脏损伤水平或较其他两种证型更接近正常人水平，瘀血阻络证中表达蛋白涉及免疫与炎症反应相关蛋白如IGJ链的特异性表达，其中结合珠蛋白大幅度降低提示瘀血阻络证。
　　5总结
　　蛋白质组学在辨证论治中能够发挥其自身的优势，在CHB不同中医证型的差异蛋白研究仍处于探索阶段，运用蛋白质组学的方法来探讨证候，发现并揭示与证候形成相关的功能性蛋白质及其特征，在整体蛋白质表达水平上阐释证候的本质仍是目前的研究热点。CHB证候间的蛋白水平差异潜在机制已有初步认識，多种差异蛋白显示中医不同证型具有自身特定的生物学基础，通过蛋白质组学研究中医证候具有十分长远的影响，兼顾个体的特征并诠释疾病共性，寻找相关蛋白与中医证候的联系、拓展并精确发现关键蛋白，从蛋白质组学角度揭示中医证候、为辨证论治、评估预后提供更多的可能性，为临床用药的选择、防治及慢性乙型肝炎向肝纤维化、肝硬变的发生、发展提供指导，相较于传统的诊断方法和单一的生化指标更符合发展趋势。
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　　收稿日期：2019-8-7;修回日期：2019-8-15
　　编辑/肖婷婷
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