胱抑素C检测及其在肾脏相关疾病中的应用

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　　摘要：胱抑素C属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，是广泛存在于植物、细菌、病毒、原生动物和哺乳动物组织中的一类重要的蛋白酶，是评定肾小球滤过率（GFR）变化的内源性标志物。其生物学变异小，不受生理因素影响，因此灵敏度、特异性均优于GFR其他内源性标志物。大量研究表明胱抑素C与急性肾衰竭、糖尿病肾病、肝脏并发肾病等肾相关性疾病的发生密切相关。本文通过对胱抑素C的生物学特性和功能、检测方法及其作一综述，以期为临床检验提供参考。
　　关键词：胱抑素C;肾小球滤过率;肾病;肾损伤
　　中图分类号：R446.11                               文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.017
　　文章编号：1006-1959（2020）04-0055-04
　　Abstract：Cystatin C belongs to the family of cysteine protease inhibitors. It is an important protease widely found in plant， bacterial， viral， protozoan and mammalian tissues. It is an endogenous marker to assess changes in glomerular filtration rate （GFR）. Because its biological variation is small and is not affected by physiological factors， its sensitivity and specificity are better than other endogenous markers of GFR. Many studies have shown that cystatin C is closely related to the occurrence of kidney-related diseases such as acute renal failure， diabetic nephropathy， and liver-complicated nephropathy.This article reviews the biological characteristics and functions of cystatin C， its detection methods， and its application in kidney lesions and other diseases involving kidneys， in order to provide a reference for clinical tests.
　　Key words：Cystatin C;Glomerular filtration rate;Kidney disease;Kidney injury
　　胱抑素C（cystatin C）是目前对肾功能检测最灵敏的指标之一，其对肾小球滤过率轻微变化的评定较血清肌酐更为敏感和特异。胱抑素C具有良好的稳定性，故测定中可忽略年龄、性别、体重、肌肉含量、炎症、胆红素、溶血、甘油三酯、进食等因素的影响;同时胱抑素C具有生物學变异小、特异性高、灵敏度好、且检测方法自动化程度高等特点，已广泛应用于各类肾脏疾病检测与鉴别。此外，胱抑素C在一系列生理、病理过程中发挥着重要作用，与心脑血管、肿瘤、肝纤维化等疾病有一定相关性。大量研究表明[1]，胱抑素C参与了糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮性肾炎、急慢性肾衰竭等多种肾脏疾病的发生和发展，在肾功能早期损害时升高，是一个反映肾功能的良好标志物。本文通过对胱抑素C的生物学特性和功能、检测方法及其在肾脏相关疾病中的作用作一综述，以期为临床检验提供参考。
　　1胱抑素C的生物学特性和功能
　　胱抑素C的基因编码位于人类第20号染色体，大约为4.3 KB，产物由122个氨基酸残基组成。因其5’端序列与管家基因的启动子区具有相同的特性，故能在所有的有核细胞内以恒定速度持续转录与表达[1]，无组织特异性，在人体所有体液中均可检测到，尤以精液和脑脊液中的浓度最高，而尿液中的浓度最低。胱抑素C是一种低分子量非糖化的碱性蛋白质[2]，能够自由的滤过肾小球，且完全被肾小管上皮细胞重吸收并于胞内降解，不重新回到血液中，又无肾小管分泌，故而成为反映肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）变化的理想内源性标志物[3]。
　　在生理条件下，胱抑素C主要功能是抑制细胞外的蛋白水解酶的活性[4]，对无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶以及溶酶体释放的组织蛋白酶B、L和H等均起到抑制作用，是迄今为止发现的对组织蛋白酶B作用最强的抑制物。胱抑素C还可以影响中性粒细胞的迁移，对细胞内蛋白质的转换，骨胶原的降解，蛋白质的分离有重要的作用，在炎性反应、动脉粥样硬化斑块的形成[5]及血管壁、细胞外基质的产生及降解的平衡过程中也发挥重要的作用，并且可参与肿瘤的侵袭和转移，具有抗病毒和原虫感染的能力，与肾脏疾病也密切有关[6]，故在医学中有非常重要的作用。
　　2胱抑素C检测方法及评价
　　2.1测定方法 　　2.1.1非均相分析方法  ①单项免疫扩散法（single radial immune diffusion，SRID）：可溶性抗原与其对应的抗体在凝胶中扩散时可在恰当的浓度处形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环，根据沉淀线的多少或沉淀环的直径来计算其胱抑素C的含量，该法具有良好的精密度及可靠性，但灵敏度差、耗时长，且操作繁琐，故临床很少使用。②放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）：用放射性物质标记的抗原与待测抗原竞争有限抗体来测定胱抑素C的含量。该法灵敏度高，检测限低（0.13 mg/L），结果准确，但存在放射性污染、试剂不易保存、操作不便、耗时长等缺点，已被临床淘汰。③荧光免疫测定法（fluorescence immunoassay，FIA）：用荧光标记抗体与待测抗原温浴反应，通过测量荧光强度，推算胱抑素C的浓度。该法具有灵敏度高、结果准确、测定快速、检测限低（0.1 mg/L）等优点，但荧光测定仪增加了测定的成本，故临床无法普及。④酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：用酶标记的抗体与待测抗原温浴反应，通过酶标仪进行比色，从而推算胱抑素C的浓度。该法由于试剂成本较低，不需要贵重仪器，适合实验室使用，但不适于急诊及大批量的样本的测定。
　　2.1.2均相分析方法  ①颗粒增强透射免疫比浊法（particle enhanced transmitted immunoturbidimetry assay，PETIA）：用兔抗人胱抑素C多克隆抗体包被羧基化修饰的肌酸颗粒与待检抗原反应，当抗原抗体形成了抗原一抗体一胶乳颗粒复合物时，会增强反应吸光度，用生化分析仪对反应液在一定波长处比浊，与同样处理的标准液比较，即能计算标本中抗原的含量。整个分析过程耗时短，因其可使抗原抗体反应的“等价带”变宽，故具有更高的灵敏度和更宽的线性范围。张双元[7]研究证实，PETIA批内、批间变异系数分别为0.9%、2.2%，其测定结果在胆红素<150 μmol/L，血红蛋白<1.2 g/L，三酰甘油<8.5 mol/L的标本中不受干扰。②颗粒增强散射免疫比浊法（particles enhance nephelometry immune assay，PENIA）：该法免疫学原理同上，但用兔抗人胱抑素C的多克隆抗体标记聚苯乙烯胶乳颗粒，采用胶乳颗粒增强的免疫散射比浊法来测定胱抑素C的含量，该法能快捷、自动测定胱抑素C，其测定结果与PETIA相关性良好，回收率为102%[8];且其敏感性、特异性、重复性和相关性均符合医学检验的要求[9]，已被广泛应用于临床。
　　2.2测定中的稳定性及干扰因素分析
　　2.2.1储存温度对其测定结果的影响  血清中的胱抑素C浓度稳定，室温下可放置2 d，0～20℃可储存7 d，-20℃至少稳定1个月，-80℃则长达6个月，反复冻融不影响测定的结果，且抗凝剂对结果的影响在临床上无实际意义。而尿液中胱抑素C也显示出极好的稳定性，在室温下24 h，4℃下48 h，-20℃下1周时间均对测定的结果无影响。
　　2.2.2储存pH值对其测定结果的影响  胱抑素C能够耐受pH≥5的尿液环境。对于酸碱度跨越比较大的区间胱抑素C也显示较广的耐受性。特别是在偏碱性的环境里，胱抑素C的测定结果稳定性更强。由于具有良好的稳定性，故检测指标中胱抑素C的可信度较高。
　　2.2.3激素对其测定结果的影响  临床上大量应用糖皮质激素治疗的患者，能够检测到其体内胱抑素C增加，而中小剂量则无此表现。Pavlaki A等[10]对36例甲状腺功能减退患者进行检测时发现，患者血清胱抑素C浓度明显下降，且会随着治疗后促甲状腺激素（TSH）水平恢复而上升。即体内某些激素会影响胱抑素C的浓度，故需结合病情对其测定结果进行分析。
　　2.2.4其它因素对测定结果的影响  有研究报道[11]，免疫抑制剂、肾小管间质损伤、恶性肿瘤（如结直肠癌）、非甾體抗炎药等均会不同程度引起血清胱抑素C浓度的升高，但有关这些影响因素的具体机制仍需进一步研究。
　　3胱抑素C在肾脏相关疾病中的作用
　　在肾功能的相关检测项目中，GFR最为常用，而迄今为止能够基本满足理想GFR内源性标志物要求的只有血胱抑素C，因其仅经肾脏清除，在自由滤过肾小球后，被近曲小管重吸收并完全代谢，无肾小管分泌，产生速率恒定、血中浓度不受性别、年龄、饮食、炎症、肌肉量等因素影响，且往往在病程早期即有明显异常，已受到临床广泛的关注。有研究表明[12-15]，胱抑素C对在肾脏病变具有良好的评估和诊断价值。
　　3.1在急性肾功能衰竭中的应用   急性肾功能衰竭是指肾脏功能的突然下降，为临床危重患者的常见并发症，具有病情重，进展快，死亡率高等特点。有研究发现与传统标志物肌酐相比胱抑素C对危重患者发生急性肾功能衰竭的早期诊断可提前2 d。因此，胱抑素C可作为早期诊断急性肾功能衰竭的重要指标之一，但其在急性肾损伤的临床效用依需要进一步研究[16]。
　　3.2在糖尿病肾病中的作用  糖尿病性肾病是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，亦是糖尿病患者的主要死因。该病由于缺乏早期的检测指标，无法在病程的早期施行干预，约1/3的糖尿病患者病情继续发展，累及微血管，导致肾小球硬化，进展至临床蛋白尿期，并最终发生肾功能衰竭，故对其进行早期的检测及防治具有重要的临床意义。现今临床多以尿微量白蛋白排泄率作为早期肾脏损伤的金标准，但其灵敏度有限，且月经、尿路感染、污染、恶性肿瘤、运动等均对其产生干扰，故在此类患者的诊断中，必须综合可靠的GFR进行评定。胱抑素C相比于血肌酐更优，对尚未出现微量蛋白尿的轻度肾损伤的患者有足够的灵敏度和可靠性，可有效弥补尿微量白蛋白检测中因低灵敏度而无法早期确诊的劣势。血清胱抑素C还可以对已确诊糖尿病但无肾脏损伤的患者进行动态观察，以监测糖尿病患者发生潜在肾损伤的情况，但是胱抑素C测定糖尿病肾病早期肾损伤程度的标准如何量化还有待进一步考证[17-20]。 　　3.3在腎移植中的作用  肾脏在移植之后，可能会由于急、慢性的排斥反应或者是免疫抑制剂治疗所产生的毒性作用而受到损伤。因此较早对移植功能损害程度进行评估，有利于及时采取有效的干预措施。研究表明[21]，胱抑素C在这类出现排斥的患者中，浓度增高得更早、更明显，且还能及时反映肾功能的恢复情况，尤其是对移植肾功能延迟的患者情况，但免疫抑制剂计量以及病理性细胞死亡的增加对胱抑素C浓度的影响尚需进一步深入研究。
　　3.4在肝肾综合征中的作用  肝肾疾病是由于门脉高压、腹水等因素导致肾脏的损伤，因此及早发现并予以干预治疗是防止肝肾综合征的重要措施。有报道以胱抑素C含量为自变量，肾功能指标为应变量进行单因素回归分析显示，血清中胱抑素C的含量与肾功能受损程度呈正相关[22]。也有研究发现[23-26]，在血肌酐正常的肝损伤患者中有部分患者可查出胱抑素C升高，表明胱抑素C可以更早提示肝损伤患者的肾功能损伤情况。因此，推荐对肝损伤患者进行胱抑素C的检测以预防肝肾综合症的发生。
　　3.5在原发性高血压中的作用  高血压因其复杂的发病机制极易并发多种疾病，肾脏是其最常见的受损靶器官，即使是轻、中度原发性高血压患者，也会因全身小动脉病变、弹性减低，导致肾小管、肾间质、肾小球呈继发性的缺血损伤，甚至进展为尿毒症。而高血压肾病患者早期发生肾损害时基本没有明显的临床表现，且常规的肾功能评价指标在疾病早期的灵敏度较低，当患者出现蛋白尿或其他肾功能损伤的明显临床表现时，肾功能损害已较为严重。研究证实[27-29]，对于常规肾功能及尿常规检查均无异常但已存在高血压早期靶器官损害的患者，血胱抑素C检测价值尤为明显，其含量与24 h收缩压、颈总动脉内膜中层厚度及左室质量指数密切相关，且升高的程度与肾脏损害程度密切相关。因此，临床常将血胱抑素C与尿微量蛋白联合，以期降低高血压导致的肾脏损伤率。
　　3.6在化疗中的作用  化疗药物对肾小管有一定的损伤，而当肾功能受到损害时，化疗药物更容易积蓄并导致多方面的毒副作用，最终进入恶性循环，因此密切关注化疗病人血清胱抑素C的水平，可以有效的监测肾功能、及时调整药量和疗程，防止肾脏的过度损伤及发生相关的并发症。
　　3.7在诊断肾源性胸水方面的作用  肾脏疾患、肝脏疾患、心功能异常等均可引起胸水，而对胸水的治疗需要依赖于原发病，故对其病因的鉴定至关重要。孙继兴等[30]对漏出性胸水患者的血清和胸水中的胱抑素C浓度进行检测，结果发现血清胱抑素C和胸水血清胱抑素C均明显升高，且比值接近1.0，可作为肾源性胸水的诊断指标（r=0.954）;而在肾功能不全合并胸水患者的渗出液中，若两者均明显升高，极有可能是尿毒症性胸膜炎;若两者比值很高或很低，即可排除肾源性胸水。
　　4总结
　　胱抑素C是目前发现的最有价值的反映肾小球滤过率的标志物，其优越性远超过了血肌酐、尿素氮等，且其对于诊断早期肾损伤具有更高的敏感性，但是目前临床对胱抑素C的应用多是联合其它项目综合评定病情，而非完全替代血肌酐、尿素等临床常规检测项目。在胱抑素C的测定方法中，PETIA法耗时最短，检测过程高度自动化，较PENIA、SRID、RIA、FIA、ELISA等具有更高的灵敏度和更宽的线性范围，故推荐其作为测定的首选方法。越来越多的研究表明血清胱抑素C水平与肾脏病变及其它疾病累及肾脏的疾病发生密切相关，其作用机制涉及抗炎、抑制酶与激素前体的活性等多方面，将成为这些疾病诊断中有效的分子指标之一。总之，随着分子生物学及临床检测水平的的不断发展，胱抑素C在基因转录及翻译水平与众多疾病的关系将会被逐步阐明，为临床监测疾病、改善预后将起到积极的作用。
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　　收稿日期：2019-11-20;修回日期：2019-11-30
　　编辑/杜帆
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