香味茶花远缘杂交亲本云南核果茶Pyrenaria yunnanensis Hu香气成分分析
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摘要：芳香味是评价名优茶花品种的重要园艺性状，培育具有芳香味的茶花品种是茶花育种的重要研究方向。采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC/MS）联用仪测定技术对香味茶花远缘杂交亲本云南核果茶（Pyrenaria yunnanensis Hu）香气成分进行分析，共鉴定出32种香气化合物，可分为醇类、萜烯类、酯类、烷烃类、酮类和芳香烃类6类。其中，醇类化合物含量最高，占香气总成分的68.19%，香气主体成分为芳樟醇、1，8-桉叶素、苯乙醇、癸酸乙酯、十二甲基环六硅氧烷、桧烯、氧化芳樟醇、1-己醇8种化合物。研究结果明确了云南核果茶的花香成分，为芳香茶花品种的选育提供理论依据，同时为茶花花香成分代谢途径关键酶基因的克隆和后续的分子育种奠定基础。
关键词：香味茶花;云南核果茶;花香成分;气相色谱-质谱联用仪
中图分类号：S685.140.1
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2020）02-0192-05
收稿日期：2018-12-04
作者简介：樊玉花（1993—），女，云南玉溪人，硕士研究生，主要从事木本观赏植物的遗传育种研究。E-mail：1113441589@qq.com。
通信作者：蔡艳飞，博士，副研究员，主要从事高山杜鹃和茶花的栽培及遗传育种研究。E-mail：caiyanfei1013@126.com。
山茶（Camellia L.）花色艳丽、花容娇美、密叶苍绿、经冬不凋，不仅是世界著名的观赏花卉，也是我国传统十大名花之一。具有怡人的芳香味是名优茶花品种的重要园艺性状[1]，然而，在已经登录在册的2万余个茶花品种中，具有芳香气味的茶花品种只有21个，如烈香（High Fragrance）、玛丽安（Mariann）、克瑞墨大牡丹（Kramers supreme）等，绝大多数茶花品种都没有芳香气味[2]。培育花色丰富且具有芳香气味的茶花品种已成为茶花育种的重要趋势。然而，山茶属植物中仅有少数几个种或品种具有明显的芳香气味，对这些资源的重视度和开发研究均较少。充分发掘带香味的近缘野生资源，开展远缘杂交，则有可能培育出具有芳香味的茶花育种中间材料或茶花新品种。
云南核果茶（Pyrenaria yunnanensis Hu）属于山茶科（Theaeeae）核果茶属（Prenaria BI.）常绿灌木或乔木，分布于海拔1 600～2 400 m的山坡阔叶林，其花呈白色，单生于上部叶腋，具有浓郁的芳香味，且花期在5月[3]。前期笔者所在课题组以具有芳香味的云南核果茶为母本，无香味的云南山茶品种狮子头（Lion Head）、早桃红（Early Crimson）、靖安茶（Jingan Camellia）、帕克斯博士（Dr. Clifford Parks）为父本进行远缘杂交，成功获得了一定数量的远缘杂交后代植株。通过表型观测，杂交后代植株也具有芳香气味，但其母本云南核果茶的香气组成成分并不清楚。
目前，对许多带有芳香气味的植物花的挥发性成分进行了分析，如香水月季复合群（Rosa odorata complex）[4]、桂花（Osmanthus fragrans L.）[5-6]、小苍兰（Fressia hybrida）[7]、杜鹃（Rhododendron L.）[8]等都有过研究，对山茶属茶树（C. sinensis L.）的茶叶香味成分做过分析[9-11]，对普洱大叶种乔木茶（C. sinensis var. assamica）花的香气成分也进行了分析[12]，但对于山茶花的花香成分分析仅报道了芳香茶花品种克瑞墨大牡丹。
本研究以云南核果茶盛花期花瓣为试料，利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪测定技术对其香气成分进行分析，不仅可以了解云南核果茶的花香成分，为芳香茶花品种的选育提供理论指导，同时为进一步了解茶花花香成分代谢途径关键酶基因和后续的分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料供试材料为云南核果茶（图1），树龄8年，树高经修剪后为2～3 m，以苗木形式保存于云南省农业科学院花卉研究所茶花种质资源圃。于12：00采摘云南核果茶花朵样品，开放程度为盛花。
1.2 试验方法
1.2.1 顶空固相微萃取 顶空固相微萃取参照林榕燕等的方法[7，13]，首先对固相微萃取头（headspace solid phase micro extraction，SPME;100 μm PDMS纖维，Supelco，USA）进行预处理，将100 μm PDMS/DVB萃取纤维在气相色谱进样口 250 ℃ 条件下老化60 min。然后称取1 g茶花花瓣，塞入收集瓶中，将收集瓶放入40 ℃水浴中，插入SPME萃取头，萃取40 min。
1.2.2 GC/MS检测 萃取完成后，用Trace DSQ-GC-MS气相/质谱联用仪（Thermo Corporation，USA）进行GC-MS分析，GC/MS检测参照李晋华等的方法[4，10]，气相色谱条件如下：色谱柱采用 DB-5MS 熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）;进样口温度为250 ℃，运载气体为 99.99% 氦气，1 mL/min的流速进行不分流进样;程序升温：保持5 min的50 ℃初始柱温，以3 ℃/min的速度升至 210 ℃，平衡3 min，然后再以15 ℃/min的速度升至230 ℃，最后在230 ℃保持8 min。
质谱条件：EI为离子源，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，接口温度为280 ℃，电子倍增器电压为350 V，m/z为35～400进行质量扫描，2.8 min溶剂延迟。
1.3 数据分析 花瓣萃取后经GC/MS分析，并将GC/MS分析得到的数据在NIST 08.L标准谱库上进行检索，对照拟合指数，结合标样进行定性分析。运用峰面积归一化法进行定量分析，得到各组分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 花香成分分析
云南核果茶花香成分的GC/MS总离子流色谱图如图2所示，每个峰表示1种化合物。从盛花期的花瓣中共检测出了32种化合物，检出的主要芳香成分及相对含量见表1。从图2和表1可以看出，云南核果茶的香气成分比较复杂，相对含量差异较大，最高的有28.93%，最低的只有0.16%。出峰时间按分子量由大到小的顺序排列，分子量小的先出峰，环状的出峰比链状晚，有双键的出峰比无双键的晚，直链的出峰比支链晚。在检测出的化合物中有多组化合物是同分异构体，如分子量为170的有2个，均为醇类化合物;分子量为136的有7个，均为萜烯类化合物。
在检测出的32种化合物中，醇类化合物最多，有12种;萜烯类化合物次之，有9种;酯类、烷烃类、酮类化合物的数量基本一致，酯类化合物有3种，烷烃类化合物有4种，酮类化合物有3种;芳香烃类化合物最少，仅有1种。
2.2 花香化合物组分含量及分类
云南核果茶花瓣中检测到的32种化合物可以分为醇类化合物（68.19%）、酯类化合物（9.69%），烷烃类化合物（7.66%）、酮类化合物（2.87%）、萜烯类化合物（10.53%）和芳香烃类化合物（0.63%）共6类（图3）。结合表1和图3可以看出，花香化合物组分多的相对含量较高，组分少的相对含量较低，如醇类化合物的组分最多，为12种，其相对含量为 68.19%，远远高于其他化合物总和，在香气成分中占主导地位;萜烯类化合物为9种，其相对含量为10.53%;芳香烃类化合物仅有1种，其相对含量仅为0.63%。
2.3 云南核果茶香气的主体成分
如表1和图3所示，云南核果茶香气成分中含量最高的为醇类化合物。在检出的醇类化合物中，主要为芳樟醇（28.93%）、1，8-桉叶素（13.21%）、苯乙醇（11.20%）、氧化芳樟醇（4.63%）、1-己醇（4.55%）5种。在其他化合物中，相对含量较高的还有癸酸乙酯（6.31%）、十二甲基环六硅氧烷（5.41%）和桧烯（5.09%），其相对含量均在4.00%以上（表2）。上述8种化合物相对含量占香气成分的79.33%，其余24种化合物占总香气成分的20.67%。因此，云南核果茶的香气主体成分为表2中所列出的8种化合物，其中，又以芳樟醇含量最高，其相对含量为28.93%，明显高于排在第2位的1，8-桉叶素（相对含量为13.21%）。因此，在云南核果茶的香气成分中，芳樟醇起主导作用。
3 讨论与结论
芳香气味是评价名优茶花品种的重要园艺性状，但在茶花品种中带有芳香气味的品种极少，培育带有芳香气味的茶花品种已成为茶花育种的重要目标之一。前期研究发现，云南核果茶具有浓郁的芳香味，并且在前期的育种工作中也发现以其为亲本的远缘杂交后代植株也带有芳香味，对其进行花香成分分析，将为芳香味茶花品种的培育奠定基础。
本研究通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪测定技术，首次分析了云南核果茶盛花期花瓣的花香成分，得到32种香气化合物。其中，醇类化合物的相对含量居首位，醇类化合物中又以芳樟醇的含量最高，相对含量达28.93%，其他的香气主体成分还有1，8-桉叶素、苯乙醇、癸酸乙酯、十二甲基环六硅氧烷、桧烯、氧化芳樟醇、1-己醇等，这些挥发性物质一起构成了云南核果茶浓郁独特的芳香气味。
本研究的结果和其他芳香型植物存在一定异同处。香水月季复合群的主体香气成分为苯乙醇、2-苯乙醇和香叶醇、橙花醇等单萜醇类[4]，苯乙醇是香水月季复合群的主要芳香成分，具有清甜的玫瑰样花香[14];桂花中的花香则主要源自萜烯类物质[5];在杜鹃花中，1，8-桉油酸、丁香酚、β-蒎烯的相对含量较高[8];小苍兰中香味的主要成分是醇类跟烯烃类化合物，并且以芳樟醇的贡献率最大[7]。云南核果茶中香味成分主要为醇类，且主体成分为芳樟醇，这与范正琪等对芳香味的茶花品种克瑞墨大牡丹的主体花香成分分析结果[1]一致，说明云南核果茶与克瑞墨大牡丹的香型类似。此外，在对普洱大叶种乔木茶花香气成分的分析中也发现芳樟醇为主要成分[12]。芳樟醇具有铃兰类的鲜爽型花香，芳樟醇氧化物则具有百合花或玉兰花香型[15]，1，8-桉叶素具有樟脑气息和清凉的草药味，苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香;在云南核果茶中检测出的香气成分中，相对含量较少的松油醇具有紫丁香香型，2-庚酮有类似梨的水果香味[14]，这些香型共同组成了云南核果茶独特的香味和香型。
云南核果茶香味浓郁独特，其挥发性成分可以用于开发香料、精油、化妆品、生活用品。此外，云南核果茶已与其他茶花成功进行了远缘杂交，获得了杂交后代植株，这为培育芳香型茶花品种提供了重要的育种亲本和中间材料。
独特浓郁的芳香味、纯白色的花朵、5月开花等特性赋予了云南核果茶作为香味茶花远缘杂交亲本的重要育种价值。以云南核果茶为茶花远缘杂交的育种亲本，有望培育花期不同且带有芳香味的名优茶花品种。本研究对云南核果茶的花香成分进行分析，共鉴定出32种香气化合物，以醇类化合物的相对含量最高，其中，又以芳樟醇的含量最高。研究结果明确了云南核果茶的花香主体成分，不仅为进一步开展茶花花香育种奠定基础，还可以為进一步了解茶花花香成分代谢途径关键酶基因和后续的分子育种奠定基础。
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