汶川地区细叶百合栽培种的快繁体系探索
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摘 要：本文探究了汶川地区细叶百合栽培种的快速繁殖体系，通过采用不同种类不同配比的植物生长调节剂处理细叶百合鳞片，研究了细叶百合鳞片扦插的最适处理条件;以细叶百合的鳞片和叶片为外植体，对细叶百合组培快繁体系进行了探索。结果表明：以鳞片为扦插材料，最适单一植物生长调节剂处理条件为20mg/L GA3浸泡1h，最适植物生长调节剂混合处理条件为20mg/L GA3加100mg/L NAA浸泡1h;以鳞片为外植体进行组织培养，最佳分化为MS加0.1mg/L NAA加0.2mg/L KT加3.0mg/L 6-BA，最适生根培养基为1/2MS加0.6mg/L IBA;以幼嫩叶片为外植体进行组织培养，较佳的消毒条件为75%乙醇浸泡20s，然后用0.1%HgCl2浸泡10min。
关键词：细叶百合;扦插;组织培养;植物生长调节剂
中图分类号：S-3 文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530003
我国是百合自然分布中心，种类繁多且分布范围广。细叶百合（Lilium pumilum Redouté）又名山丹百合，是百合科百合属多年生草本植物，因花朵红若丹霞，美丽娇艳，观赏价值极高，深受人们青睐[1]。此外，其还具有食用和药用价值[2]，其鳞茎有滋阴安神润肺之效，其花有解毒消肿、活血祛瘀之效。细叶百合具有极强的抗性和耐盐碱能力，是百合育种的优良亲本[3]。由于生长环境的破坏和人们的采挖，野生细叶百合的数量急剧减少[4-6]，但细叶百合的市场需求却逐年增加，人工栽培是保护野生资源及满足市场需求的唯一途径，而种球的繁育则是人工栽培要面对的问题。目前，关于细叶百合鳞片扦插繁殖和其各器官组织培养的报道有不少[7]。但是众所周知，一种植物在不同生活环境，不同生理状态下内源激素的状态和数量有较大差异，不同器官组培的分化情况和促分化条件也有较大差异。细叶百合主要的分布区位于我国较干旱少雨的北方，笔者于3a前将其引种到位于西南地区“华西雨屏”的四川省汶川地区，经驯化栽培，目前长势良好，本研究以汶川地区细叶百合驯化栽培种为材料，探究了植物生长调节剂对扦插鳞片发生再生植株的影响;同时以细叶百合鳞片和叶片为外植体，研究了其组培快繁条件。本研究对于细叶百合组培快繁技术体系的完善，特别是在潮湿多雨地区的繁育工作具有一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料及药品
供试植物细叶百合引种于陕西延安，驯化栽培于四川阿坝师范学院花卉繁育基地。试验所用MS培养基为自配，所用无机盐均为分析纯级，培养基添加蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.8%。
1.2 实验方法
1.2.1 材料预处理
1.2.1.1 扦插鳞片处理方法
取细叶百合鳞片用0.2%的多菌灵溶液浸泡30min，再用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡3min，晾干1d待用[8]。
1.2.1.2 扦插基质处理方法
采用草炭∶珍珠岩为1∶1的比例充分混匀，再用沸水浸泡30min，2层纱布悬挂滤去多余水分，至手握土壤成团而不滴水。
1.2.1.3 组培鳞片外植体处理方法
取细叶百合内层鳞片，洗去杂质，置于含少量洗衣粉的溶液中浸泡15min，再用流水冲洗0.5h，在超净工作台用灭菌后的滤纸吸干多余水分待用。
1.2.1.4 组培叶片外植体处理方法
取细叶百合的幼嫩叶片，洗去杂质，缓水流冲洗0.5h待用。
1.2.2 细叶百合鳞片扦插再生植株条件探究
1.2.2.1 单一植物生长调节剂处理对细叶百合小鳞茎分化的影响
用4%的高锰酸钾擦拭扦插床消毒，将预处理好的鳞片以20片为1组，分别用50mg/L、100mg/L和150mg/L的IBA溶液，5mg/L、15mg/L和20mg/L的GA3溶液，50mg/L、100mg/L和200mg/L的NAA溶液，浸泡鳞片1h（见表1），每一条件重复3次。在扦插床底部先铺1层4～6cm厚的扦插基质，将处理好的鳞片腹部朝上按序平放于基质上，然后再覆蓋1层4～6cm厚的扦插基质[2，8]，将扦插床置于阴凉环境下，每隔5d做1次扦插鳞片生长情况的检查和记录。
1.2.2.2 NAA和GA3组合处理对细叶百合小鳞茎分化的影响
将预处理好的鳞片以20片为1组，用0mg/L GA3分别添加0mg/L、100mg/L、200mg/L的NAA;10mg/L GA3分别添加0mg/L、100mg/L、200mg/L的NAA;20mg/L GA3分别添加0mg/L、100mg/L、200mg/L的NAA共9个条件的处理液，分别浸泡每组鳞片1h（见表2），每一条件重复3次，扦插和观测方法同单一植物生长促进剂处理的情况。
1.2.3 以鳞片为外植体的细叶百合组培快繁体系研究
1.2.3.1 鳞片外植体的消毒和切割
将预处理好的鳞片用75%的乙醇浸泡2min，用无菌水冲洗5次，再用0.1%的HgCl2浸泡13min，然后用无菌水冲洗5次以清除残余的HgCl2[9]，将灭菌后的鳞片每片去除边缘后，按0.5cm×0.5cm大小切割成鳞片块。
1.2.3.2 初代培养
预实验以NAA搭配KT探究促分化激素水平，发现在NAA0.1mg/L加KT0.2mg/L有少量分化的情况，主要为愈伤组织，并在此基础上，另添加6-BA以促进不定芽的诱导。将消毒切割好的鳞片分别接种于NAA0.1mg/L加KT0.2mg/L加6-BA1.0mg/L、NAA0.1mg/L加KT0.2mg/L加6-BA2.0mg/L、NAA0.1mg/L加KT0.2mg/L加6-BA3.0mg/L 3种不同激素配比MS培养基上（见表3）。每个培养瓶接种2片外植体，以20片外植体为1组，每一激素条件下做3组重复，置于20～25℃，2000lx光照，每天光照12h的条件下培养，每5d做1次鳞片生长分化情况的观察记录。 1.2.3.3 小鳞茎诱导生根
将初代培养产生的丛生小鳞茎从组培瓶中取出，分离为适宜大小，以20份为1组，分别接种于含有IBA0.3mg/L、0.6mg/L和0.9mg/L的1/2MS培养基上（见表4）。每一激素条件做3组重复，置于20～25℃，2000lx光照，每天光照12h的条件下培养，每5d做1次鳞片生长分化情况的观察记录。
1.2.4 以叶片为外植体的细叶百合组培快繁初探
将预处理好的叶片每20片分为1组，分别采用75%酒精浸泡20s加0.1%HgCl2浸泡5min、10min;75%酒精浸泡30s加0.1%HgCl2浸泡5min、10min的消毒条件处理（表5）。每个灭菌条件下做3组重复，接种于MS加NAA1.5mg/L加2，4-D2.0mg/L的促分化培养基[10]，置于培养室培养，培养条件同鳞片外植体，7d后统计污染率，10d后统计坏死率，25d后统计分化率。
1.2.5 组培苗炼化栽培
将培养瓶从培养室取出，在室内无阳光直射处放置3d，然后打开培养瓶瓶盖继续培养3d，再将小苗取出洗净根部琼脂，移栽至经消毒的培养基质中，培养基质为泥炭土∶珍珠岩为1∶1[11]，置于阴凉处缓苗，30d后统计成活率。
1.2.6 数据统计分析
平均生根数=生根总数/（接种数×成活率）;
平均小鳞茎数=小鳞茎总数/（接种数×成活率）;
愈伤组织诱导率=（诱导分化外植体数/接种外植体总数）×100%;
扦插成活率=（成活鳞片数/接种鳞片总数）×100%;
分化率=（分化外植体数/接种外植体总数）×100%;
坏死率=（坏死外植体数/接种外植体总数）×100%。
试验数据用Excel进行整理，采用Spss25.0软件对试验数据进行方差分析，多重比较，数据的表示形式为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 不同生长调节剂对细叶百合鳞片扦插繁殖的影响
2.1.1 单一植物生长调节剂处理对细叶百合小鳞茎分化的影响
以细叶百合鳞片为材料，通过不同浓度梯度不同类型植物生长调节剂浸泡处理，以探究生长调节剂对细叶百合鳞片扦插繁殖小鳞茎的影响，扦插40d后对鳞片成活率、鳞片产生的小鳞茎数和生根数做统计，相关结果见表1。从表中可以看出，用15mg/L的GA3浸泡处理的细叶百合鳞片成活率最高，达96.67%，但其产生的平均小鳞茎数和平均生根数较其它处理条件偏低;用20mg/L的GA3浸泡处理的细叶百合鳞片的成活率虽只居于第2，但在该条件下每个鳞片产生的小鳞茎数和生根数都是最高的，每个鳞片平均产生小鳞茎1.80个、根2.12条，且小鳞茎和幼根生长状况都良好。综合来看，用20mg/L的GA3浸泡处理的细叶百合鳞片产生小鳞茎的数量最多，长势良好，为GA3处理的较佳浓度;用IBA浸泡细叶百合鳞片也有较高的成活率，其中100mg/L的IBA浸泡处理有最高成活率81.67%，但是用IBA处理的鳞片产生的平均小鳞茎数远低于20mg/L GA3处理的结果，且差异具显著性;而用NAA浸泡处理细叶百合鳞片虽然成活鳞片平均产生小鳞茎数也较高，但是各浓度条件下的成活率都较低，且表现为NAA浓度越高鳞片成活率越低。综上，对细叶百合鳞片扦插繁殖有最佳促进作用的单一植物生长调节剂处理条件为20mg/L GA3浸泡1h。
2.1.2 NAA和GA3组合处理对细叶百合小鳞茎分化的影响
以不同浓度NAA和GA3组合处理细叶百合鳞片，扦插40d后对鳞片成活率、鳞片产生的小鳞茎数及生根数做统计，相关结果见表2。从表中可见用20mg/L GA3加100mg/L NAA浸泡小鳞茎有最高的成活率78.33%，但此条件下鳞片产生的小鳞茎平均数却不是最高的，平均每片鳞片产生小鳞茎1.47个;10mg/L GA3加100mg/L NAA浸泡鳞片的成活率为76.67%，在各处理条件中位于第2，鳞片产生的平均小鳞茎数为1.85个，也位于各处理条件中第2的位置，鳞片平均生根数则为各处理条件最高。综合看来，10mg/L GA3加100mg/L NAA浸泡鳞片是实验中各处理条件中最优的。
2.2 以鳞片为外植体的细叶百合组培快繁体系研究
2.2.1 初代培养
以细叶百合鳞片为外植体材料进行不定芽的诱导，45d后统计的实验结果见表3。在相关培养条件下，鳞片外植体通常先产生愈伤组织，紧接着就会产生小鳞茎或不定芽。从表3中可以看出，不同类型培养基诱导鳞片外植体产生愈伤组织的诱导率存在显著差异，最适激素配比为：NAA0.1mg/L加KT0.2mg/L加6-BA3.0mg/L，在该条件下鳞片外植体产生愈伤组织的诱导率最高，达60.0%，鳞片分化产生小鳞茎数也最多，平均每个鳞片外植体可产生小鳞茎2.3个。
2.2.2 生根培养
以初代培养产生的小鳞茎和不定芽为外植体，以添加不同浓度IBA的1/2MS培养基为生根培养基进行生根培养，30d后统计诱导生根情况，相关情况见表4。从表4中可以看到，1/2MS加IBA0.6mg/L的培养条件最有利于诱导生根和根的生长，诱导分化生根率达78.33%，平均生根数为2.66条，根粗壮，平均长度为2.77cm，为3个处理条件中最好的，所以1/2MS加IBA0.6mg/L为细叶百合最佳生根培养条件。
2.2.3 试管苗移栽
將诱导生根小苗，按照实验方法中描述的炼化栽培方法处理，30d后统计成活率，成活率为92.9%。
2.2.4 不同外植体消毒条件对细叶百合叶片组培成活率的影响
以细叶百合叶片为外植体，以MS加NAA1.5mg/L加2，4-D2.0mg/L为促分化培养基进行组织培养，发现叶片外植体坏死率极高。试验对细叶百合叶片外植体消毒条件进行了探究，培养7d后统计染菌外植体数，10d后统计坏死率，25d后统计愈伤组织分化情况，相关结果见表5。从表中可以看到，75%乙醇浸泡20s加0.1%HgCl2浸泡10min的消毒条件坏死率较低，与坏死率最低的处理条件75%乙醇浸泡20s加0.1%HgCl2浸泡5min相比，差异不显著，同时外植体染菌的情况明显低于后者，存活外植体25d后部分出现了愈伤组织分化。由此可见，75%乙醇浸泡20s加0.1%HgCl2浸泡10min的处理条件为几个消毒条件中效果最理想的。
3 讨论与展望
细叶百合的鳞茎在野生百合中体积较小，所以其鳞片也较小较薄，扦插时易脱水坏死，也易污染杂菌。因此，进行细叶百合的鳞片扦插，需要对鳞片进行仔细清洗和消毒处理，同时扦插基质也需要消毒。从实验结果看，一定浓度的赤霉素GA3处理有利于扦插鳞片的成活，也有利于小鳞茎的生成，其效果甚至优于GA3加NAA联合处理;单独使用NAA浸泡细叶百合鳞片会明显影响小鳞片的成活率，但与GA3联合处理时鳞片成活率有显著提高，相关机理有待进一步研究。
以细叶百合鳞片为外植体进行组织培养，较易诱导分化获得愈伤组织或小鳞茎，这与多数百合属物种的情况是一致的;而以细叶百合叶片为外植体组培时，外植体材料极易坏死，分化率很低，也与多数百合属物种的情况一致。所以，细叶百合的组织培养宜以鳞片为外植体，初生培养可采用MS加NAA0.1mg/L加KT0.2mg/L加6-BA3.0mg/L诱导产生不定芽和小鳞茎，生根培养可采用1/2MS加IBA0.6mg/L的培养条件。
当前，鳞片扦插仍然是细叶百合繁育采用的主要手段[12]，但扦插繁育小鳞茎繁殖系数低、成球慢困扰着细叶百合种球生产[7];组培时一片鳞片可以切分为多份外植体，在本研究数据看，组培时一个外植体平均分化的小鳞茎数也高于一片用于扦插的鳞片。综合来看，鳞片组培相对于鳞片扦插具有更高的繁殖系数，鳞片组培有短期内应用于细叶百合种球生产的潜力。
迄今为止，关于鳞片扦插繁殖技术的研究只探究植物生长调节剂和扦插基质对鳞片再生植株的影响，有关小鳞茎形成和发育的生理机制研究非常薄弱，因此，深入研究鳞片繁殖环节的生理代谢机制，可能是解决鳞片扦插繁殖系数低突破口。细叶百合组织培养技术的研究也大多数以鳞片为外植体材料进行研究[13]，但细叶百合种球小、鳞片少，若以叶片作外植体既不影响植株生长，材料又更容易获取。从实验结果看，细叶百合叶片可以分化产生愈伤组织，但坏死率高和分化率低的问题有待解决。细叶百合叶片纤细，作为外植体时若消毒条件稍剧烈就易坏死，消毒时间短又易染菌，有待探索更加有效的叶片消毒方案。
参考文献
[1] 王琦，雷家军，郑洋.细叶百合种内居群形态多样性研究[J].江苏农业科学，2009（02）：140-142.
[2]惠东东.山丹研究现状[J].农民致富之友，2018（18）：49.
[3]金淑梅，杨利平，杨丰山.细叶百合的形态特征比较研究[J].黑龙江农业科学，2008（05）：94-95.
[4]梁振旭.我国中西部地区野生百合资源调查收集与评价研究[C].中国园艺学会观赏园艺专业委员会、国家花卉工程技术研究中心.中国园艺学会会议论文集.厦门：中国园艺学会，2015：16-21.
[5]靳磊，禹文杰，张瑞军.宁夏野生细叶百合资源调查[J].现代园艺，2018（15）：26-27.
[6]葛蓓孛，杨青杰，吴萍，等.细叶百合组织培养植株再生[J].东北林业大学学报，2010，38（05）：54-56，59.
[7]孙红梅，贾子坤，陆阳，等.百合鳞茎扦插繁殖的研究进展[J].北方园艺，2009（02）：141-146.
[8]金淑梅，杨利平，郑成建.细叶百合的无性繁殖[J].东北林业大学学报，2002（06）：47-49.
[9]蒋细旺，司怀军.百合的组织培养技术综述[J].湖北农业科学，2004（01）：78-82.
[10] 张悦，王健鹂，王秀峰，等.野生细叶百合组织培养体系的建立[J].北方園艺，2015（11）：95-97.
[11]孙旭才，冯春光，黄春燕，等.细叶百合组培继代培养与生根移栽的研究[J].河北林果研究，2008（02）：211-213.
[12]丁仁展，熊丽，陈敏，等.百合鳞茎扦插时机和方法对籽球新芽萌生形态及开花的影响[J].西南农业学报，2007（06）：1299-1303.
[13]陈丽静，殷小娟，李俊岚，等.细叶百合鳞茎诱导与遗传转化组培体系的建立[J].西南农业学报，2013，26（02）：718-722.
（责任编辑 周康）
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