青海省樱桃叶斑病病原菌的分离与鉴定

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　　摘要 为明确引起青海省樱桃叶斑病病原菌的种类，本研究从西宁市城北区、海东市乐都区和贵德县的樱桃上采集有叶斑症状的叶片，采用组织分离法分离出病原菌，通过观察病原菌的形态特征，结合rDNA-ITS、EF-1α和Alt a 1基因序列分析对病原菌的种类进行了鉴定，并用柯赫氏法则进行验证。结果表明，共获得279株病原菌菌株，分属链格孢Alternaria alternata、细极链格孢A.tenuissima和刺盘孢属Colletotrichum spp.，分离频率分别为84.95%、5.02%和10.03%。采用柯赫氏法则进行离体叶片致病性测定，接种叶片100%发病，说明引起青海省樱桃叶斑病的病原菌为链格孢、细极链格孢和刺盘孢属真菌，且链格孢为主要病原菌。该研究结果可为青海省樱桃叶斑病的综合防治提供理论依据。
　　关键词 樱桃; 叶斑病; 链格孢属; 刺盘孢属; Alt a 1基因; 系统发育
　　中图分类号： S 436.62  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019567
　　Abstract In order to confirm the pathogen of cherry leaf spot in Qinghai province， the typical diseased cherry leaves were collected from Chengbei district of Xining city， Ledu district and Guide county of Haidong city. The pathogen was isolated by tissue separation method and identified by morphological observation and sequence analysis of rDNA-ITS， EF-1α and Alt a 1 genes. The pathogenicity of the strains were tested by Koch’s postulates. The results showed that 279 strains were obtained， belonging to Alternaria alternata， A.tenuissima and Colletotrichum spp.， with the isolation frequencies of 84.95%， 5.02% and 10.03%， respectively. Koch’s postulates test demonstrated that 100% incidence was found on the inoculated leaves， indicating that the pathogens causing cherry leaf spot disease in Qinghai province are A.alternata， A.tenuissima and Colletotrichum spp.， and A. alternaria is the main pathogen. The results provide a theoretical basis for the comprehensive prevention and control of cherry leaf spot in Qinghai province.
　　Key words cherry; leaf spot; Alternaria spp.; Colletotrichum spp.; Alt a 1 gene; phylogeny
　　 櫻桃Prunus avium 又名迎庆果、含桃，蔷薇科李属落叶乔木果树。因果实色泽鲜艳，营养丰富，酸甜可口，而深受人们的喜爱，有“百果第一枝，早春第一果”的美誉[1]。世界上樱桃主要分布在美国、加拿大、欧洲等北半球国家，在国内作为果树栽培的樱桃有中国樱桃、甜樱桃、酸樱桃和毛樱桃，主要分布在山东、陕西、四川等地[2]。由于其果实经济价值高，近年来，在我国各省市得到大面积推广栽培，我国樱桃的栽培面积日益增加，目前已居世界首位[3]。随着栽培面积的不断扩大，发生在樱桃上的病害也呈现出明显加重的趋势。目前，国内外危害樱桃产业的病害主要有樱桃褐斑病[4]、流胶病[5]、根癌病[6]、灰霉病[7]、褐腐病[8]和叶斑病[9]等。其中樱桃叶斑病是世界范围内危害樱桃产业的真菌性病害，在欧美国家发生极其严重，给当地果农造成了巨大经济损失，严重阻碍了樱桃产业的健康发展[10-15]。目前，引起樱桃叶斑病的病原菌有Blumeriella jaapii[16]、Calonectria ilicicola[17]、Pseudocercospora pruni-persicicola[18]、Cylindrosporium padi[19]和Phoma herbarum[20]。此外， Thomidis 和 Tsipouridis[9]于2006年报道了希腊樱桃叶斑病的病原菌为链格孢属真菌中的小孢子种链格孢Alternaria alternata。我国学者赵远征等[21]于2013年在大樱桃果实上分离出链格孢，并证实了该种病原菌人工有伤接种可侵染叶片。但在自然条件下由链格孢属真菌和刺盘孢属真菌引起樱桃叶斑病的研究在国内尚未见报道。
　　本研究组在2017年-2019年对青海省樱桃病害进行系统调查时发现两种新的叶部病害普遍发生。在发病最为严重的7、8月份，病株率高达100%。发病叶片形成圆形或近圆形的褐色或紫红色病斑，大小不等。发病严重时，病斑相互连接，扩展至整个叶面，导致光合作用严重受阻，树势衰弱，第二年果实产量降低。为明确青海省樱桃叶斑病的病原菌，本研究采用组织分离技术对病原菌进行分离，柯赫氏法则进行致病性测定，结合形态学和分子生物学手段对病原菌进行鉴定，以期为青海省樱桃叶斑病病原菌的科学诊断和病害的综合防治提供理论基础和技术支持。 　　1 材料与方法
　　1.1 病叶的采集
　　樱桃病叶于2017年-2019年采自青海省西宁市城北区、海东市乐都区和贵德县。叶斑病A共采集90片病叶，其中西宁市城北区3片，海东市乐都区76片，贵德县11片;叶斑病B共采集44片病叶，其中海东市乐都区40片，贵德县4片。采集发病症状典型的新鲜樱桃病叶放入采样袋内，及时带回实验室分离。
　　1.2 病原菌的分离与纯化
　　采用组织分离法[22]对病原菌进行分离，用 PDA培养基培养3～5 d后，在无菌条件下用打孔器在菌落边缘切取直径为5 mm的菌饼接种在PDA平板上，进行纯化和转接培养。纯化2～3次后，将菌株接种在试管斜面PDA培养基上，置于4℃保存备用。
　　1.3 病原菌的形态学鉴定
　　用灭菌打孔器在菌落边缘切取直径为5 mm的菌饼接种在PDA和PCA培养基的中央，每天观察并记录菌落的形状、大小、颜色以及菌丝的生长状况等形态特征。为了更清晰地观察病原菌的形态特征，在PCA培养基上斜插无菌盖玻片，待菌落生长7 d后，取出PCA培养基中的插片，置于载玻片上，滴一滴清水，制成临时玻片，于显微镜下观察记录病原菌的菌丝形态，分生孢子梗和分生孢子的形状、大小、颜色、着生方式以及有无隔膜等特征，并参照张天宇[23]对链格孢属真菌种级形态的描述及Sutton[24]对刺盘孢属的分類方法鉴定病原菌的种类。
　　1.4 病原菌的分子生物学鉴定
　　采用CTAB法[25]提取病原菌的总DNA。分别以通用引物ITS1和ITS4[26]、EF1-728F和EF1-986R[27]、Alt-for和Alt-rev[28]进行PCR扩增，所用引物见表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系均为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL（含Mg2+），模板DNA 0.5 μL，dNTPs 1.0 μL，引物各 0.5 μL（10 μmol/L），5 U/μL Taq酶0.2 μL，用ddH2O补齐。94℃ 预变性4 min;94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 1 min，30个循环; 72℃延伸10 min，4℃保温。扩增完成后，在1%琼脂糖凝胶中通过150 V和100 mA电泳检测5 μL扩增产物20 min，用SanPrep柱DNA J凝胶回收试剂盒（SK8131，上海生工）回收PCR扩增产物，并送至上海生工进行双向测序。测序结果与GenBank数据库中的核酸序列进行BLAST同源性比较分析。利用ClustalX 1.8和MEGA 5.1进行序列间的比对分析，将3条基因序列按照rDNA-ITS、EF-1α和Alt a 1的顺序进行多基因序列整合，以邻接法（NJ）构建菌株的系统发育树，并用自展法（bootstrap method）进行检验，重复1 000次，分析该菌与同属菌株间的亲缘关系[1]。
　　1.5 病原菌的致病性测定
　　采用离体叶片接种方式进行病原菌的致病性测定。将纯化后的病原菌菌株接种在PDA平板上，25℃恒温，黑暗倒置培养6 d。用灭菌打孔器在菌落边缘打出直径为5 mm的菌饼，接种在健康樱桃叶片上。采用有伤（针刺）和无伤两种接种方式，先用自来水冲洗掉叶片表面的杂质，再用75%乙醇消毒30 s，灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将叶片表面的水分吸干后，进行有伤和无伤接种，每个叶片接种6个菌饼，重复3次，用空白PDA培养基作为对照。置于25℃的恒温培养箱中，黑暗培养7 d后调查发病率，并对发病叶片再次进行病菌分离和鉴定。具体方法是用灭菌剪刀在发病叶片病健交界处剪取0.5 cm×0.5 cm的病组织小块，于超净工作台上用75%乙醇消毒3 min，无菌水冲洗3次，放在灭菌滤纸上晾干后，接种在PDA平板上，置于25℃恒温培养箱中培养，待菌落长出后进行形态学和分子生物学鉴定。发病率=发病叶片数/接种叶片总数×100%。
　　2 结果与分析
　　2.1 发病症状
　　叶斑病A发病初期在叶片上形成大小不一的褐色斑点，后病斑逐渐扩大为圆形或近圆形褐色斑，直径为2.23～11.67 mm，病斑处干枯、皱缩，略微凹陷，且产生同心轮纹，中间为黄褐色或浅褐色，病健交界处深褐色且随着病斑的不断扩大产生离层，常由此脱落形成穿孔。病斑背面直径为2.30～11.35 mm，颜色较正面浅，为黄褐色，同心轮纹不明显。发病严重时，病斑相互连接形成不规则的病斑块，且扩展范围不受叶脉限制。发病严重的叶片失水严重，萎蔫、皱缩、柔韧性降低，尤其是病斑处因干枯而出现裂痕（图1）。叶斑病B发病叶片形成圆形或近圆形的紫褐色病斑，直径为1.47～4.60 mm，病斑内部很小部分为黄褐色，向外为紫色环，且最外层有紫红色光晕。病健交界处不产生离层，不形成穿孔。病斑背面为紫红色，直径为1.13～4.52 mm。发病严重时，病斑相互连接，扩展整个叶面，使叶片干枯、皱缩（图2）。
　　
　　2.2 病原菌的分离与纯化
　　对两种叶斑病的病原菌进行分离和纯化，共获得279株分离物，其中从叶斑病A的病叶中分离出153株，包括西宁3株，海东135株，贵德15株。通过培养形态和镜检分别将西宁3株分类命名为CBX001;海东135株分类命名为HS002（11株）、LD002（3株）、GM001（5株）、JX001（5株）、LJH001（22株）、LJH002（2株）、YR001（2株）、TGW001（78株）、TGW003（7株）;贵德15株分类命名为GDX001（4株）、GDX003（2株）、GDD001（5株）和GDH001（4株）。从叶斑病B的病叶中共获得126株病原菌株，包括海东113株，分别命名为TGT001（82株）、TGT002（28株）和TGT003（3株）;贵德13株，均命名为GDY001。 　　2.3 病原菌的形态学鉴定
　　病原菌株CBX001、HS002、LD002、GM001、JX001、LJH001、YR001、TGW001、GDX001、GDD001、GDH001、TGT001和GDY001在PDA平板上菌落为圆形，呈灰黑色或墨绿色绒状，边缘整齐，背面深橄榄绿或黑色。培养初期，菌丝呈放射状生长，为白色，后逐渐变为灰白色、灰色或黑色，多卷曲交织成绒毛状。气生菌丝发达，致密，生长迅速，7 d后菌落直径达9 cm（图3 a和b）。在显微镜下，病原菌的菌丝为无色，宽3～5.5 μm，有隔膜。分生孢子梗浅褐色或棕褐色，着生于菌丝末端或侧面，直立或屈膝状弯曲，有分隔，大小为（42.3～96.5）μm×（3.2～4.7）μm。分生孢子黄褐色或褐色，长椭圆形、卵形、棍棒状或倒梨形，有1～5个横隔膜，0～3个竖或斜隔膜，分隔处大多具有缢缩现象，大小为（9.6～35.5）μm×（6.5～15.5）μm。分生孢子着生于分生孢子梗顶端或侧面，呈链状生长，每条链上有2～6个孢子。分生孢子链具有二次分支现象，形似树状。分生孢子多数具有喙，短喙为浅褐色柱状或锥状，长喙棕褐色且具有分隔，大小为（3.2～21.3）μm×（3.4～5.1）μm（图3 c和d）。
　　
　　 菌株LJH002、TGW003、GDX003和TGT003在PDA上菌落为圆形，呈灰褐色或墨绿色绒状，边缘整齐，背面深橄榄绿或黑色。菌丝粗壮，菌落粗糙，培养初期菌丝呈放射状生长，为白色，后逐渐变为灰色、墨绿色或黑色。气生菌丝发达，致密，生长迅速，9 d后菌落直径达9 cm（图4a和b）。分生孢子梗浅褐色，多数单生于菌丝侧面，偶有分支，直立或略弯曲，有分隔，大小为（26.5～83.9）μm×（3.6～5.2）μm。分生孢子浅褐色或褐色，椭圆形、卵形、棍棒状，少数倒梨形，有1～7个横隔膜，0～5个竖或斜隔膜，分隔处有明显缢缩现象，成熟的孢子常有1～4个主横隔膜因较粗而颜色加深，为黑褐色，大小为（15.7～46.8）μm×（7.2～15.7）μm。分生孢子呈链状生长，不分支或少分支，每条链上有6～10个孢子。喙或假喙柱状或锥状，浅褐色，有隔膜，基部略微膨大，大小为（3.3～3.4）μm×（3.4～4.9）μm（图4c和d）。
　　菌株TGT002在PDA平板上菌落圆形，呈粉红色、灰白色或灰褐色毛绒状，边缘整齐，背面粉红色、橘黄色或紫褐色。培養初期，菌丝呈白色或粉红色，后逐渐变为灰白色或灰色，且菌落出现同心轮纹。气生菌丝发达、致密，生长迅速，6 d后菌落直径达4.8 cm（图5 a和b）。病原菌菌丝直径为1.92～5.79 μm，透明且有隔膜。分生孢子梗无色，着生于菌丝侧面，单生且有隔膜，具有分枝。分生孢子梭形、圆柱状，光滑透明，无隔膜，大小为（10.72～15.82）μm×（3.75～6.86）μm（图5 c和d）。
　　
　　2.4 病原菌的分子生物学鉴定
　　提取分类命名后18株病原菌的总DNA，经PCR扩增、测序后将结果提交至NCBI网站进行BLAST同源性比较分析。结果表明，基于rDNA-ITS基因序列所测长度为545～583 bp，EF-1α基因所测序列长度为253～285 bp，Alt a 1基因所测长度为480～532 bp。将病原菌的rDNA-ITS、EF-1α和Alt a 1基因序列合并构建系统发育树，结果表明， 13株菌株以100%支持率与A.alternata聚为同一支，4株菌株与A.tenuissima以100%支持率聚为一支（图6）。病原菌TGT002构建的系统发育树结果显示，该菌与刺盘孢属真菌中的多个种聚为一支（图7）。
　　2.5 279株病原菌的鉴定结果和分布
　　结合病原菌的形态特征和系统发育分析结果，从叶斑病A病叶中分离出的153株病原菌被鉴定为链格孢属中的两个小孢子种：链格孢142株和细极链格孢11株，分离频率分别为92.8%和7.2%。西宁、海东和贵德三个地区的不同采集地点均分离出了链格孢菌，其中西宁3株、海东126株、贵德13株;而只有在海东和贵德分离出了细极链格孢，分别为9株和2株。从叶斑病B病叶中分离出的126株病原菌中，95株被鉴定为链格孢，3株被鉴定为细极链格孢，28株被鉴定为刺盘孢属，分离频率分别为75.4%、2.4%和22.2%。海东和贵德两个采集地点均分离出了链格孢，其中海东82株、贵德13株; 而3株细极链格孢和28株Colletotrichum spp.均从海东樱桃病叶上分离得到。
　　
　　2.6 病原菌的致病性测定
　　分别从三类菌株中各选取1株代表性菌株HS002（链格孢，乐都）、GDX003（细极链格孢，贵德）和TGT002（刺盘孢属，乐都）进行致病性测定，结果表明，3株菌株接种的叶片均在接种后第3 天开始发病，且有伤和无伤接种均可发病，发病率为100%。菌株HS002和GDX003接种的叶片发病初期病斑呈暗褐色，后病斑逐渐扩大为圆形或近圆形褐色斑，病斑处出现同心轮纹，与田间自然发病症状相同;菌株TGT002接种的叶片病斑呈褐色，大小不等，后病斑逐渐扩大为圆形红褐色或紫褐色斑，病斑处干枯且出现裂痕，而对照组叶片未发病（图8）。从菌株HS002、GDX003和TGT002接种发病叶片上再次进行病菌分离，分别将病原菌命名为HSZ002、GDX003-HJT和TGT002-HZ。经镜检后其形态（图3e～h、图4e～h和图5e～h）与上述供试菌株形态一致，且HSZ002和GDX003-HJT在系统进化树上与供试菌株聚为一支（图6）。
　　
　　3 讨论
　　本研究结合形态学和分子生物学手段，最终将青海省樱桃叶斑病的病原菌鉴定为链格孢、细极链格孢和刺盘孢属，分离频率分别为84.95%、5.02%和10.03%，且链格孢为引起青海省樱桃叶斑病的主要病原菌。这是国内首次发现在自然条件下链格孢属真菌和刺盘孢属真菌能够引起樱桃叶斑病。 　　世界上已报道的链格孢属真菌有500多种，且95%寄生在不同植物上，具有寄主范围广，传播途径多，侵染能力强和危害程度大等特点[29]。该类菌种引发的病害在经济作物、粮食作物和果蔬生产中均有发生[30]，严重阻碍了我国农业生产的发展。
　　与其他真菌相比，链格孢属真菌具有明显的特征，易于区分，但种级间的特征存在很大变异，特别是属内的小孢子种极易受培养条件的影响而产生趋同现象，使链格孢属真菌难以鉴定到种[31]。传统的链格孢属真菌分类方法以形态学为主，系统发育为辅，这种方法在一定程度上满足了一些菌种的分类要求，但易受人为因素和环境条件的干扰，使得菌种之间的进化距离和亲缘关系不能被准确反映，菌种的鉴定结果也存在一定的偏差[32]。近年来，随着分子生物学技术，尤其是PCR技术的广泛应用，使得人们从分子水平上认识到菌种的遗传和进化情况，更能准确地进行菌种鉴定，基于此技术，一些研究者结合形态特征对链格孢属种级分类鉴定及其系统发育做出了广泛的研究：宋顺华等[33]、Hong等[34]和赵金梅等[35]利用rDNA-ITS序列对病原菌进行了分类鉴定，赵艳琴等[36]利用rDNA-ITS和EF-1α基因序列鉴定了病原菌的种类;赵圆等[37]和岳海梅等[38]利用endo PG序列，曲文文等[31]利用ITS序列并结合随机片段OPA2-1和OPA1-3基因序列对链格孢属种间的进化情况及其亲缘关系进行了系统发育分析。
　　本研究利用rDNA-ITS、EF-1α和Alt a 1三个基因序列对致病菌株的系统发育进行了研究，这些序列在一定程度上反映了菌种的进化程度和亲缘关系的远近，但rDNA-ITS和EF-1α基因序列却很难区分链格孢属真菌中形态相近的小孢子种，由此推测rDNA-ITS和EF-1α基因在链格孢属真菌的遗传进化中存在一定的变异性，这与张荣等[39]和岳海梅等[40]的研究结果相似。特异性基因位点Alt a 1基因的保守性较其他已知基因位点高，且在链格孢属不同种间遗传信息差异大，可以将病原菌准确鉴定到种，Hong等[28]也对此进行过详细的研究并得到相同的结果。本研究还单独利用rDNA-ITS序列对刺盘孢属进行系统发育分析，但该序列不能将病原菌准确鉴定到种。正如符丹丹[41]在对中国苹果炭疽病病原菌遗传多样性研究中所发现的那样，ITS序列在对刺盘孢属真菌中部分种进行鉴定时很难将其准确区分。因此，对刺盘孢属进行准确鉴定还需探索更多保守性较强的特异性基因位点。
　　本研究鉴定出的3种病原菌均为国内首次发现其在自然条件下能够侵染樱桃葉片，引发叶部病害。本研究结果可为这3种病原菌的进一步研究和青海省樱桃叶斑病的有效防控提供依据。
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　　（责任编辑： 田 喆）
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