大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
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【摘要】心肌细胞分离技术出现后，各国实验室都对其进行了全面的研究分析，本文主要探求的是稳定的大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。本文综合国内外分离技术，最终采用酶消化法分离单个心肌细胞，并且利用相应的培养基进行培养，同时结合免疫荧光法对细胞进行鉴定，以判断分离培养技术是否合理。
【关键词】大鼠心肌细胞;分离鉴定技术;细胞培养方法;胰蛋白酶
【中图分类号】R363 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.1..02
引言：大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养工作已经有五十多年的历史，但是心肌细胞的分离、鉴定、培养上还存在一定的局限性。在这样的情况下，加强对分离培养技术的探索，有效延长心肌细胞的生长、存活的时间，可以为心肌细胞的研究工作提供更好的研究样本，为国家的基因研究做出贡献。
1 试验材料
为了保证得到的结果科学有效，试验中选择了某大学医学院实验动物中心提供的健康大鼠，同时准备了Sigma公司的I型胶原酶、胰蛋白酶、Na2ATP，MgATP、阿糖胞苷等分析材料。除此之外，还准备了无钙Tyrode液、正常Tyrode液、酶液、细胞保存液，并且用NaOH将这些液体的pH调节值至7.38，为了保证细胞培养工作的顺利进行，在试验前还采用了GIBCO公司的优级胎牛血清（FCM）和DMEM/F12培养基等材料。
2 试验方法
2.1 单个心肌细胞的分离
本文采用酶消化法分离单个心肌细胞，在进行心肌细胞分离的过程中，首先，要让大鼠脱臼昏厥。朝大鼠腹腔内注射肝素500 U/kg，五分钟后大鼠就会在肝素的作用下昏厥。其次，要取出大鼠心脏。用剪刀剪开大鼠胸腔后，让心脏充分暴露出来，并且将心脏剑侠，放置在4℃的生理盐水中清理。再次，要对大鼠心脏进行灌流。采用心脏离体灌流装置，对心脏主动脉进行逆行插管并且缝线扎紧，同时用还要对其进行预热，当温度在37℃时，就可以正式进行主动脉逆行灌流。需要注意的是在这个环节中，要保证灌流速度在9～10 mL/min范围内。逆行灌流的过程中，涉及无钙Tyrode液、正常Tyrode液、酶液这三种液体，液体顺序、时间各不相同，其中酶液最后灌注且灌注时间最长。最后，要完成保存处理。在完成灌流后，剪下心室保存在准备好的细胞保存液中并剪碎，需要注意的是，至少要静置一小时后，才能够应用到细胞实验中，在一小时内，心室碎片在室温下可以更好完成复钙任务。
2.2 细胞记录方法和形式
在室温保存一个小时后，大鼠心室肌细胞就可以放置在正常胜利浓度钙中，想要具体检测耐钙心室肌细胞个数，可以通过高倍或者低倍镜，计算得到杆状细胞总数以及球形细胞总数，然后利用杆状细胞总数除以上述两种细胞之和，就可以得到具体的个数数据。
2.3 心肌细胞的培养观察
除了要对细胞进行分离的之外，还要对细胞进行培养观察，最佳的传代培养时间在细胞生长增殖至培养板的80%～90%这一阶段。首先要将培养液吸去，利用无血清的细胞培养液对细胞进行冲洗，一般情况下要冲洗2～3次;其次要在每个孔内添加0.25%的胰蛋白酶200 μL，等待3～5分钟，待细胞的完全消化吸收后，在进行下一阶段的操作;再次在每个孔内加入20%的FBSDMEM/F12培养液，在这个过程中，要将细胞吹起并打匀，然后就可以按照1：2的比例进行传代培养工作;最后，将得到细胞的放置在温度为37℃、浓度为5%的二氧化碳培养箱内，培养24小时后，将20%的FBSDMEM/F12培养液更换为10%的FBSDMEM/F12培养液。经过上述处理后，就可以利用显微镜观察大鼠心肌细胞的成长状态和形态特征，需要注意的是在观察的过程中，要实时测定大鼠心肌细胞的搏动次数。
2.4 心肌细胞的化学鉴定
本文以免疫组织化学鉴定过程为例，在实际鉴定过程中，一共分为四个环节，第一个环节，将大鼠心肌细胞分离、培养后得到的细胞放置在0.25%胰蛋白酶中，让其消化、吹散;第二个环节，待细胞消化吹散后，将其移入6孔板中，并且在孔板内设置无菌盖玻片，进而将温度为37℃、浓度为5%的二氧化碳培养箱内;第三个环节，静置48小时后，无菌盖玻片上会长满细胞，将盖玻片去除放入平皿中，加入固定液，固定25分钟后利用PBS反复冲洗3次，每次控制在3分钟左右;第四个环节，按照顺序，依次对无菌盖玻片滴加科学设计的浓度配比的过氧化酶阻断溶液、羊血清、ɑ-actin抗体、生物素标记羊抗小鼠抗体、链霉菌抗生物素、过氧化物酶溶液，每次滴加液体后，都要在室温下孵育10分钟，其中ɑ-actin抗体较为特殊，需要孵育60分钟，最终加入新鲜配制的DAB显色液并且完成封片后，就可以进行观察[1]。
3 试验结果
3.1 形态学观察
按照具体的步骤完成试验过程后，将得到大鼠心肌细胞倒置在显微镜下进行观察，记录不同时间节点下，大鼠心肌细胞的生长和形态状态，结合大鼠心肌细胞的搏动次数，最终得到了不同培养时间后（8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、7～10天、40天、45天）在倒置相差显微镜下观察原代培养心肌细胞。8小时后，细胞就会逐步的贴壁生长;24小时后，细胞均已贴壁，并且从圆形或卵圆形转变扁平形、梭形，还有部分细胞会呈现出三角形，且顶部较为突出。48小时后，研究人员发现，细胞出现了自发性脉搏搏动，虽然整体搏动节律较为缓慢，但是搏动持续，每分钟平均搏动8～10次;72小时后，细胞逐渐生长开，搏动也日益明显，可以达到每分钟60次，部分细胞会伸出伪足，形状从扁平形、梭形、三角形，变为不规则星形，可能会出现多个、单个细胞核，但是单个细胞核的情况较多，细胞核为原型，核仁较为清晰;96小时后，大部分细胞都会生出伪足，且较为清晰民享，细胞搏动频率更加明显，的平均次数增加，绝大部分细胞都会变成不规则星形。120小时后，细胞形成细胞簇，细胞簇会出现同步搏动的情况。7～10天后，就可以开始传代培养，每三天开展一次传代培养，细胞逐渐成熟。40天～45天，开始逐渐出现细胞变性死亡的情况[2]。
3.2 检测的结果
经过间接免疫荧光检测以及免疫组织化学鉴定的情况来看，通过阴性对照结果来看，加入cTnT抗体的小鼠心肌细胞在胞膜和胞浆中均呈绿色荧光，也就是说，cTnT抗体呈阳性。同时根据免疫组织化学鉴定的情况来看，心肌细胞的分离培养在七天后，就进行了ɑ-actin抗体检测，检测结果呈阳性反应，肌原纤维较为清晰。综合这两种鉴定检测结果可以得出，大鼠心肌细胞分离培养的过程中，生物特性不会发生改变，受到一些生长因子的影响，一些细胞在离体后可以存活40～120天，部分生长力较为旺盛的细胞可以持续培养1年左右。也就是说大鼠心肌细胞分离培养可以在细胞学、动物学、生物化学、免疫学中得到应用，还需要注意的是，因为本文采用的是酶消化法分离单个心肌细胞方法，除了这种分离培养方法之外，还有很多其他的方法，这些方法各具优缺，因此要根据实际需求，科学的选择分离培养方式，比如：消化培养法在实际应用中，虽然操作便捷，但得到的细胞较少[3]。
总结：综上所述，通过对大鼠心肌细胞分离培养鉴定研究，对大鼠的心肌细胞有了全面的了解，作为生物医学实验研究中最常使用的品种，在日后还需要进一步加强对其的研究分析工作。
参考文献
[1] 付 微，刘 飞，乔陆明，张绪东.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定[J].牡丹江医学院学报，2017，38（05）：6-8+5.
[2] 程 俊，曾曉荣，谭晓秋，等.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法[J].四川生理科学杂志，2016，38（04）：187-189.
[3] 何 璐.大鼠心肌干细胞的分离培养与鉴定及鹿茸多肽对其分化的诱导作用研究[D].吉林大学，2016.
本文编辑：董 京
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