2株鸽源沙门氏菌病原的分离鉴定及诊治分析
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摘 要：为探究引起山东两个规模化养鸽场种鸽死亡病原，本研究成功从两鸽场中各分离到一株革兰氏阴性菌，并进行纯化、PCR鉴定、药敏试验及血清型鉴定试验。结果显示，成功分离出的2株分离菌的16S rRNA片段测序确定均为沙门氏菌，两株沙门氏菌的药敏结果存在一定差异，但均对头孢类、氨基糖苷类及四环素类等敏感;分子血清分型试验结果表明2株分离菌均为鼠伤寒沙门氏菌。经治疗后死亡情况得到控制，该研究结果为鸽沙门氏菌病的流行及防治提供思路和参考。
关键词：鸽;沙门氏菌;分离鉴定;血清型
中图分类号：S858.395.1 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2020）2-0017-05
鸽沙门氏菌病又称鸽副伤寒，能够引起下痢、关节炎、运动神经障碍等症状。病原菌的血清型多数为鼠伤寒沙門氏菌哥本哈根变种，该菌极少感染人类[1]，部分为阿贡纳沙门氏菌及科瓦利斯沙门氏菌等[2]。本病广泛存在于世界各地，既能够水平传播也能垂直传播，绝大多数发生于1岁以下的鸽子，并能导致死亡，成年鸽子感染此病死亡率较低，但经过一段时间后会成为传染源。
2019年11月份，山东两个规模化养鸽场出现了种鸽每天死亡5～6羽的情况。病鸽精神呆滞，缩头闭眼，食欲差或不食，有的呼吸困难，部分下痢，排白色、淡绿色或深绿色稀便，便中常带小气泡，中心为未消化的饲料，肛周羽毛被粪便沾污。部分患鸽逐步脱水、消瘦，最后衰竭而死。通过临床观察及实验室分析，诊断为沙门氏菌感染。本研究通过细菌分离、血清型鉴定及耐药分析等，为预防鸽沙门氏菌病的发生及抗生素的使用策略提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 病料为18～24月龄发病鸽。PCR扩增试剂盒购自Axygen公司;药敏纸片购自北京艾博利德商贸有限公司;细菌培养基及其他试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 细菌分离鉴定
1.2.1 细菌分离 无菌条件下分别取病鸽肝脏，接种于5%胎牛血清培养基，于厌氧环境中培养18～24h，观察记录细菌生长状况及形态。挑取培养或纯化后的单菌落，涂片进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态及染色特性。
1.2.2 PCR扩增及系统发育树构建 鉴定细菌16S rRNA通用引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。取单个细菌菌落悬浮于50μL生理盐水作为模板， 按照如下比例配制反应体系：模板1μL，上下游引物（20pmol/μL）各0.5μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，补充去离子水至25μL。反应条件为：95℃预变性5min，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。将PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果经BLAST比对分析，选取GenBank中已登录的基因序列进行同源比对，采用MEGA7.0软件中Neighbor-joining方法构建其进化树。
1.3 药物敏感试验 按照WHO推荐的琼脂纸片扩散法（K-B）对分离菌进行药敏检验，最后测量药敏试验抑菌环直径，结果按NCCLS标准做出判定。
1.4 分子血清分型 参照文献[3]中合成引物，引物序列见表1。
取单个细菌菌落悬浮于50μL生理盐水作为模板， 按照如下比例配制反应体系：模板1μL，上下游引物（20pmol/μL）各0.5μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，补充去离子水至25μL。反应条件为：95℃预变性5min，95℃ 30s，退火1min（退火温度见表1），72℃ 1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。取5μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。
2 结果与分析
2.1 剖检结果 部分急性死亡者，多无明显病变，仅见肝、肾肿大，个别输卵管内见有1枚鸽蛋。病程稍长的可见肝肿大，有的呈古铜色心，有针头至粟粒大小的灰白色坏死灶。肾肿大、输尿管有白色尿酸盐沉积;肠壁增厚，肠粘膜充血、出血，肠道内有充满黄绿色或绿色带有泡沫样的糊状物。雌鸽卵泡充血、出血、变形。有的卵黄坠入腹腔发生腹膜炎。雄鸽睾丸肿大或缩小，有点状坏死。病例未曾见到关节型和神经型的病变。
2.2 细菌分离与纯化 无菌采集肝脏接种于血清培养基中，37℃培养18～24h后，培养基上长出直径大约1mm的细小、光滑、表面湿润的灰白色菌落，染色镜检可见分离菌呈两端椭圆或卵圆形，不形成芽孢和荚膜的革兰氏阴性小杆菌，大小（0.6～0.9）×（1～3）μm，两株菌分别命名为SM-JQ30-2019、SM-JQ31-2019。
2.3 16S rRNA PCR扩增及系统发育树构建 将分离株进行16S rRNA PCR扩增，在约1500bp处各有一特异性条带。将测序结果与GenBank数据库中序列进行比对、分析，结果显示两株菌与Salmonella enterica（CP032490.1）的相似度分别为99.93%、99.65%，选择沙门氏菌几个亚种构建系统进化树（图1），结果显示两株菌均与Salmonella enterica（MH548459.1）位于同一分支，结合培养特性及细菌形态，鉴定2株菌均为沙门氏菌。16S rRNA核苷酸序列系统进化树见图1。
2.4 分子血清型鉴定 对分离株进行血清型鉴定发现，只有SB及S. Typhimurium两对引物有阳性条带，其余均为阴性，结果表明2株分离菌的血清型均为鼠伤寒沙门氏菌。血清型坚定PCR电泳图见图2。 2.5 藥敏试验分析 采用12种常规抗生素药敏纸片进行药敏试验，结果显示，2株分离菌对林可霉素类抗生素完全耐药，对头孢类、氨基糖苷类及四环素类等均敏感，2株菌对大环内酯类及喹诺酮类的敏感性存在一定差异。药敏试验结果见表2。
3 防治措施
目前，第3代头孢菌素和第3代喹诺酮类药物是治疗沙门氏菌感染的常用药物，根据本试验药敏试验结果进行耐药分析，结合养殖场的用药情况，选择头孢类抗生素头孢他啶进行治疗。全群状况好转，发病率和死亡率降低，整体情况得到控制;另一方面，要做好养殖场生物安全、卫生消毒制度等。
4 总结
鸽沙门氏菌病是一种常见病和多发病，该病的发生是由多方面因素造成的，因此，本病从防治角度进行，预防大于治疗，从源头切断该病的传播，可以大大减少生产损失。沙门氏菌血清型众多，目前根据免疫血清学的方法可将其分出46个血清组，2523种血清型[4]，传统平板凝集可能需要几天时间，现在PCR技术等分子方法已开始广泛应用于沙门氏菌血清分型研究中[5]。
本研究中，已证实从山东两个有下痢等症状的种鸽场中分离得到的2株细菌均为鼠伤寒沙门氏菌，说明鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型，这与我国华东[2]、华南[6]等报道一致。药敏试验结果显示2株分离菌存在一定差异，但对林可霉素类抗生素均完全耐药，对头孢类、氨基糖苷类及四环素类等均敏感。这与已有报道中鸽源鼠伤寒沙门氏菌的药敏结果存在很大不同[7-9]，这是由于各地区、养殖场等用药背景不同，使得不同菌株的耐药谱存在较大差异。根据药敏结果，选用头孢他啶治疗后，病情得到有效控制。因此，临床防控及治疗细菌性疾病时，不应盲目用药，应根据药敏试验结果分析其耐药情况，进行选择用药，以减少耐药菌的产生。
参考文献：
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[9] 姜文欣， 刘阳， 王彦红，等.1例鸽感染鼠伤寒沙门氏菌的诊断及药敏试验[J].养禽与禽病防治，2014， （03）： 2-3.
Isolation， identification， diagnosis and treatment of
two Salmonella strains isolated from pigeon
ZHAO Qiaoya，LIU Na，PAN Hua，TIAN Xue，SHI Yuying，LIU Yushan，HU Feng，HUANG Bing
（Institute of Poultry Sciences，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250023，China）
Abstract： In order to study the pathogenic conditions of pigeons in two large-scale pigeon farms in Shandong Province， one isolate was successfully isolated from each pigeon farm by liver isolation， purification， PCR identification， drug sensitivity test and serotype identification test. The 16S rRNA fragments of two isolates were sequenced and determined to be Salmonella. There were some differences in drug sensitivity results of two isolates， but they were all for cephalosporins and ammonia The results of molecular serotyping showed that the two strains were Salmonella typhimurium. After treatment， the death situation was controlled. The results of this study provide reference for the epidemic and prevention of pigeon salmonellosis.
Key words： Pigeon; Salmonella; isolation and identification; serotype
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