纤维素分解菌的筛选与鉴定

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　　摘要[目的]高效利用纤维素资源，保护生态环境。[方法]利用刚果红染色法从土壤中筛选出高效纤维素降解菌且对其进行形态学和分子学鉴定。[结果]菌株Ⅰ的纤维素酶活力0.005 3 U/mL，与Bacillus pumilus strain 35的亲缘关系为99%，命名为Bacillus pumilus WL-1，为革兰氏阳性菌。菌株Ⅱ的纤维素酶活力0.0059 U/mL，与Bacillus pumilus strain BAB-1322的亲缘关系为99%，命名为Bacillus pumilus WL-2，为革兰氏阳性菌。[结论]筛选的纤维素分解菌具有较强的纤维降解能力，可有效提高纤维素资源的开发利用。
　　关键词土壤;纤维素分解菌;筛选鉴定;纤维素酶活力
　　中图分类号X172文献标识码A文章编号0517-6611（2020）15-0001-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.001
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Screening and Identification of Cellulose Decomposing Bacteria
　　ZHANG Haiyan， WANG Wenlei， HAN Meng
　　（Department of Life Science， Luoyang Normal University， Luoyang， Henan 471934）
　　Abstract[Objective]To make efficient use of cellulose resources and protect the ecological environment. [Method]Congo red staining was used to screen highefficient cellulosedegrading bacteria from soil and identify them morphologically and molecular. [Result]The results showed that the cellulase activity of strain I was 0.005 3 U/mL and its relationship with Bacillus pumilus strain 35 was 99%. The strain I was named Bacillus pumilus WL1， which was grampositive. The cellulase activity of strain II was 0.005 9 U/mL and 99% of its relatives with Bacillus pumilus strain BAB1322. The strain II was named Bacillus pumilus WL2 and was grampositive. [Conclusion]The cellulosedecomposing bacteria screened in this study have strong cellulosedegrading ability and can effectively improve the development and utilization of cellulose resources.
　　Key wordsSoil;Cellulose decomposing bacteria;Screening and identification;Cellulase activity
　　基金项目河南省高等学校重点科研项目（19A180023）。
　　作者简介张海艳（1977—），女，山西长子人，讲师，硕士，从事生物化学教学与研究。
　　收稿日期2020-01-11
　　世界上最丰富的可再生资源非纤维素莫属，然而纤维素结晶区和非结晶区彼此交织的独特结构使得酶分子及化学试剂难以与这种致密结构的表面结合[1]，造成纤维素利用率低下。尤其是作物秸秆，大部分被焚烧，既浪费资源又污染环境[2]。纤维素具有代替粮食生产酒精、生产饲料蛋白、有机酸发酵、制取功能性寡糖等潜在功能[3]。对纤维素资源的开发和利用意义重大。目前，降解纤维素主要有高酸和高碱等处理纤维素的化学方法以及离子辐射等物理方法。这些方法条件极端，不易控制，极易造成二次污染[4]。生物法分解纤维素具有反应温和、成本较低和无污染等优点[5]。可以产纤维素酶的真菌和细菌分布广泛。王少昆等[6]在科尔沁砂质草地土壤中分离出2株分解能力较强的真菌;刘东阳等[7]从秸秆中筛选出3株蜡样芽孢杆菌属的纤维素分解菌;牛明芬等[8]从牛粪中筛选出4株高效纤维素分解菌;明红梅等[9]从白酒槽的残渣中筛选鉴定出2株羧甲基纤维素（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）酶活分别为13.7 U/g的地衣芽孢桿菌和9.25 U/g的枯草芽孢杆菌。纤维素分解菌的筛选鉴定，是高效利用纤维素资源的前提。
　　笔者以河南省洛阳市龙峪湾景区腐殖土为研究材料，通过刚果红染色法，筛选出高效纤维素分解菌，对其进行形态学及分子学鉴定，并初步研究了其生长情况和CMC酶活水平，为纤维素资源高效利用提供研究依据。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1样品采集。
　　土壤样品取自河南省洛阳市龙峪湾景区腐殖土，置于冰箱备用。
　　1.1.2主要培养基。
　　羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基、LB液体培养基、产酶培养基、滤纸条培养基，均参照文献[10-13]配制。 　　1.2方法
　　1.2.1材料预处理。将土壤样品按10-7～10-1梯度用无菌蒸馏水稀释备用。
　　1.2.2纤维素降解菌的分离筛选。
　　（1）初筛。取100 μL稀释液涂布于CMC平板上，37 ℃培养24 h，挑选生长旺盛的菌落，刚果红染色15 min，NaCl溶液脱色，选取透明圈较大的菌落。
　　（2）纯化培养。将初筛选菌落接种至LB培养基中摇床培养12 h，取少量菌液，划线在CMC培养基上纯化培养24 h，选取透明圈较大的菌落，重复上述步骤5次，保证筛选出的菌株没有杂菌。
　　（3）复筛。将纯化菌落液体培养12 h，取少量纯化菌液，点种在CMC-刚果红固体培养基上，培养24 h。NaCl溶液脱色，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d）。
　　1.2.3糖化水平和纤维素酶活的测定。
　　（1）葡萄糖标准曲线的制作。
　　配制浓度分别为0.1 mg/mL到0.7 mg/mL的葡萄糖标准溶液10 mL。取葡萄糖标准溶液0.4 mL、去离子水0.4 mL、DNS溶液1.0 mL，煮沸10 min。
　　空白对照：缓冲液0.8 mL和DNS溶液1.0 mL，煮沸10 min。
　　分别取冷却的空白对照和7种浓度的混合液100 μL，测540 nm處吸光度，制作葡萄糖标准曲线。
　　（2）糖化水平测定。
　　采用DNS显色法。产酶培养液离心后取粗酶液。粗酶液和缓冲液充分反应后，加入DNS溶液，煮沸灭活，测OD 540值。
　　（3）纤维素酶活测定。
　　将40 ℃、pH=5.0条件下，1 min内将底物转化为1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U/mL）。采用公式X=[（A a-A b）×K+c]/（M×t）×1 000进行计算，记录数据。其中：X为纤维素酶活力，A a为酶液OD 540值，A b为空白对照OD 540值，K为斜率，c为截距，M为葡萄糖分子量;t为反应时间（min）。
　　1.2.4形态学鉴定。参照《伯杰氏菌株鉴定手册》和革兰氏染色法，对菌株进行形态学鉴定[14]。
　　1.2.5分子学鉴定。采用溶菌酶和CTAB结合法提取菌株DNA[15-16]。PCR扩增菌株的16S rRNA基因。测序结果在NCBI网站上用BLAST程序进行分析。用MEGA7.0.26构建菌株16S rRNA系统发育树。
　　2结果与分析
　　2.1纤维素分解菌的筛选刚果红染色后筛选出4株透明圈明显的菌株，如图1所示。由表1可见，各菌株的D/d值由大到小依次为菌株Ⅱ、菌株Ⅰ、菌株Ⅲ、菌株Ⅳ。菌株Ⅱ的D/d值最高（3.00）。
　　2.2糖化水平和纤维素酶活分析
　　2.2.1葡萄糖标准曲线。
　　由图2可见，葡萄糖标准曲线方程和相关性系数分别为：y=0.807 1x-0.01，R2=0.998 2。散点图相关性系数R2=0.997 8。该图线性关系良好，可以为纤维素酶活的测定提供准确的计算数据和参考。
　　2.2.2糖化水平测定。图3表明，菌株Ⅱ的糖化水平最高，葡萄糖浓度为0.046 mg/mL;菌株Ⅳ糖化水平最低，葡萄糖浓度为0.029 mg/mL;菌株Ⅰ和菌株Ⅲ的葡萄糖浓度分别为0041和0.037 mg/mL。4株菌糖化水平的测定结果基本与D/d值一致。
　　2.2.3纤维素酶活测定。图4表明，菌株Ⅱ纤维素酶活力最高，为0.005 9 U/mL;菌株Ⅰ的纤维素酶活力次之，为0.005 3 U/mL;菌株Ⅳ的纤维素酶活力最低，仅为0.003 8 U/mL;菌株Ⅲ的纤维素酶活力为0.004 8 U/mL。
　　2.3形态学鉴定  选择糖化水平和纤维素酶活力较高的菌株Ⅰ、Ⅱ进行鉴定。菌落形态如图5所示，菌株Ⅰ菌落边缘整齐、干燥、无褶皱;菌株Ⅱ边缘整齐、黏稠、无褶皱;革兰氏染色均为阳性菌。
　　2.416S rRNA基因分子鉴定
　　提取菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的DNA。经PCR扩增之后，结果显示，电泳条带整齐、单一，长度在1 500 bp左右（图6）。测序结果在NCBI网站上通过BLAST程序进行比对分析，结果显示二者与芽孢杆菌属的16S rRNA基因序列同源性分别为98%和99%。
　　菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的16S rRNA系统发育树，如图7和图8所示。菌株Ⅰ与Bacillus pumilus strain 35（登录号：KX218316.1）的亲缘关系最近，为99%，结合鉴定结果，将菌株Ⅰ命名为
　　Bacillus pumilus WL-1。菌株Ⅱ与Bacillus pumilus strain BAB1322（登录号：KF725774.1）的亲缘关系为99%，结合鉴定结果，将菌株Ⅱ命名为Bacillus pumilusWL-2。
　　3结论与讨论
　　为解决纤维素资源的浪费与污染问题，该研究以纤维素为单一碳源，采用刚果红染色的方法筛选纤维素降解菌，研究方法安全便捷，高效高产。在研究过程中发现，使用刚果红溶液进行染色时，极易使菌落脱落，该研究在配制培养基时加入刚果红，可有效防止菌体脱落。鉴定该研究筛选的2株纤维素分解菌都为短小芽孢杆菌。菌株Ⅰ的纤维素酶活力0.005 3 U/mL，与Bacillus pumilus strain 35的亲缘关系为99%，命名为Bacillus pumilus WL-1，为革兰氏阳性菌。菌株Ⅱ的纤维素酶活力0.005 9 U/mL，与Bacillus pumilus strain BAB1322的亲缘关系为99%，命名为Bacillus pumilus WL-2，为革兰氏阳性菌。菌株Ⅰ和菌株Ⅱ有很好的纤维素分解效果，可进一步研究应用。 　　目前，大量前人从纤维素富集的地方筛选出了多种纤维素分解菌，经过鉴定，这些微生物有蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、绿色木霉、青霉等[17-20]，种类繁多，效果良好。该研究筛选的Bacillus pumilus WL-1和Bacillus pumilus WL-2为短小芽孢杆菌。王宏燕等[21]筛选出9株松针纤维素降解菌，D/d值最大为4.2，最小为2.0;岑贞陆等[22]筛选出1株可以分解纤维素的短小芽孢杆菌，D/d值为2.6。该研究筛选的2株纤维素分解菌的D/d值分别为3.0和2.9，可以反映出其纤维降解能力较强。
　　高效的纤维素降解菌对人类生产生活有很大作用，如在香蕉茎秆堆肥中，可加快堆体中的有机物分解;对畜禽类粪便有除臭及促进秸秆分解的作用。短小芽孢杆菌除了具备上述功能，还可能具有改善烟叶品质[23]、诱导番茄对细菌性青枯病的抗性[24]、防治水产养殖病原弧菌[25]等功能。短小芽孢杆菌适用范围广、功能多、应用潜力巨大。
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