ICAM-1在大鼠STZ糖尿病性白内障中表达的实验研究
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作者: 王晓辉 徐国兴 潘永明
[摘要] 目的：观察糖尿病性白内障晶状体上皮细胞转化生长因子β-1（TGF-β1）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和Ⅰ-胶原 （COL-Ⅰ）的表达，用以研究ICAM-1在糖性白内障发病机制中的作用。方法：120只SD大鼠随机分为两组，在糖尿病组中，一次性腹腔注射STZ建立糖尿病模型；用免疫组化SP法分别于2、4、8周末观察糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中ICAM-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表达变化及其相关性。结果：在糖性白内障组晶状体上皮细胞中ICAM-1、 TGF-β1和COL-Ⅰ的表达明显增高，与对照组比较差异有统计学意义,且TGF-β1与ICAM-1和 COL-Ⅰ之间的表达表现出明显的正相关关系。结论：在糖性白内障组晶状体上皮细胞中ICAM-1的表达明显增高，TGF-β1可以促进晶状体上皮细胞ICAM-1和COL-Ⅰ的表达，ICAM-1通过介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质粘附，促进HLEC的粘附、增生和移行，从而在糖性白内障中发挥重要作用。
[关键词] 细胞间粘附分子-1 糖尿病性白内障 晶状体上皮细胞 转化生长因子β-1 Ⅰ-胶原
糖尿病性白内障常见的病理变化是在晶状体前囊膜下和后囊膜下发生混浊[1]。当晶状体发生前、后囊膜下型白内障时，晶状体上皮细胞形成斑片样多层生长并出现类似梭状的形态特点，甚至呈成纤维细胞样改变，同时在前囊膜下型白内障的混浊斑块中存在Ⅰ型胶原和粘蛋白的表达[2]。以往研究表明，TGF-β1也能引起晶状体上皮细胞发生斑片样多层生长并出现类似梭状的形态特点[3],但其作用机制尚不明确。粘附分子是一类介导细胞间或细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白，Nishi等[4]发现术后即取的和培养的晶体上皮细胞都表达ICAM-1。因此我们推测，在糖性白内障的发生过程中，TGF-β1在诱导晶状体上皮细胞表达Ⅰ型胶原的同时，也诱导ICAM-1的表达增强，通过ICAM-1介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的粘附，诱导细胞发生斑片样多层生长，导致白内障的形成。我们通过建立链脲佐菌素大鼠糖尿病性白内障模型，检测晶状体上皮细胞（LECs）中ICAM-1、TGF-β1及COL-I的表达的变化规律，研究ICAM-1在糖尿病性白内障发生、发展中的作用。
1 实验材料
1.1 实验动物。SD大鼠（福建医科大学实验动物中心，许可证号：2002-0006）。
1.2 实验试剂
链脲佐菌素（Sigma 公司），小鼠抗大鼠ICAM-1抗体、兔抗大鼠TGF-β1抗体、兔抗大鼠COL-Ⅰ抗体（武汉博士德公司），SP免疫组化超敏试剂盒（福州迈新生物公司）。
1.3 主要仪器
OLMPUS 数码相机（C3040-ABU）、OLMPUS 光学显微镜（BH-2）、one touchⅡ血糖测定仪、电子分析天平（FA1104）、石蜡切片机(LKB-Nova 5型) 。
2 实验方法
2.1 建立糖尿病动物模型。大鼠禁食12h后，一次性腹腔注射剂量为70mg/kg的2%STZ溶液（用pH4.5，0.1mol/L的柠檬酸缓冲液临时配置），三天后采大鼠尾静脉血测血糖浓度，血糖浓度在16.7mmol/L以下的则不能视为糖尿病的大鼠。正常组仅给予腹腔注射pH4.5，0.1mol/L的柠檬酸缓冲液。
2.2 检测指标和方法。从腹腔注射STZ开始，用裂隙灯检察晶状体变化（每周1次）并监测血糖（每两周一次）。分别于实验开始后2周末、4周末及8周末，白内障组和正常组大鼠各取20只（40只眼），测血糖，称重，取眼球。取出的眼球立即用10%中性福尔马林液固定，制成0.4μm厚的石蜡切片。
2.3 免疫组织化学染色SP法检测ICAM-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表达,免疫组化实验步骤按Ultra Sensitive SP超敏试剂盒免疫组化染色步骤进行。
2.4 数据分析及统计学处理
ICAM-1主要表达于细胞膜上，阳性反应为棕黄色颗粒。TGF-β1和COL-Ⅰ主要表达于细胞浆，阳性反应为棕黄色颗粒。在光镜下随机选择观察50个晶状体上皮细胞，用阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示阳性表达率。采用两因素的方差分析、直线相关分析，以P＜0.05作为差别有显著意义的检验标准，所有统计均在SPSS11.0软件上运行。
3.2 裂隙灯下大鼠晶状体变化情况。正常组大鼠晶状体始终保持透明；而白内障组大鼠在第2周末在晶状体可见空泡出现，第4周末可见晶状体周边部出现白色絮状混浊，到第8周末混浊程度增加，混浊范围扩大。
3.3 TGF-β1的表达。正常组大鼠晶状体上皮细胞中可见到少数TGF-β1蛋白表达；白内障组的晶状体上皮细胞中可见TGF-β1明显表达。两组间的差异有显著性（t2周末=13.826，t4周末=35.012，t8周末=48.523，各组间均P<0.05）；在三个时间组中，白内障组的TGF-β1表达逐渐增多（F=503.25,P<0.05；SNK法两两比较各组间均P<0.05）；而正常组的TGF-β1表达无明显变化（F=0.266,P=0.650）(图1)。
3.4 ICAM-1蛋白的表达。正常组晶状体上皮细胞中未见到ICAM-1表达；白内障组中晶状体上皮细胞膜可见棕黄色颗粒，表明ICAM-1表达明显。两组间的差异均有显著性（t2周末=27.214，t4周末=60.542，t8周末=70.259，各组间P<0.01）；在三个时间组中，白内障组的ICAM-1表达逐渐增多（F=98.235, P<0.01；SNK法两两比较各组间P<0.05）；而正常组的无明显变化（F=0.254,P>0.05）(图2)。
3 结果
3.1 血糖测定结果。白内障组大鼠血糖在STZ注射后第3天起至第8周末均保持较高的水平；而正常组大鼠的血糖值一直保持在正常值范围（详见表1）：
图2 ICAM-1在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表达
3.5 COL-Ⅰ的表达。正常组晶状体上皮中未见到COL-Ⅰ的表达；白内障组的晶状体上皮细胞浆内可见多数COL-Ⅰ棕黄色颗粒。两组间的差异有显著性（t2周末=48.56，t4周末=40.84，t8周末=30.54，各组间均P<0.05）；在三个时间组中，白内障组的细胞阳性率逐渐增高（F=385.234,P<0.05；SNK法两两比较各组间均P<0.05）；而正常组的细胞COL-Ⅰ阳性率率无明显变化（F=1.235,P=0.401）(图3)。
图3 COL-Ⅰ在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表达
3.6 两组LECs中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表达情况比较（表2）及相关分析。经直线相关分析，在白内障发展过程中，TGF-β1与ICAM-1和COL-Ⅰ的表达变化呈正相关(r=0.623，P<0.05/(r=0.663，P<0.05) (图4，图5)。
4 讨论
在正常情况下，晶状体上皮细胞为单层细胞，排列极为规则[1]。当晶状体上皮细胞的这种正常的结构和排列发生改变时，晶状体就可能发生混浊而导致白内障的形成。研究表明，晶状体上皮细胞可缓慢增殖、移行，并在一定条件下转化为纤维细胞从而促进纤维化的形成。糖尿病性白内障最常见的病理改变为晶状体前、后囊膜下混浊[1]。近年来研究发现，当晶状体发生前、后囊膜下型白内障时，晶状体上皮细胞形成斑片样多层生长并出现类似梭状的形态特点，甚至呈成纤维细胞样改变，同时在前囊膜下型白内障的混浊斑块中存在Ⅰ型胶原和粘蛋白的表达[2]。本实验表明，STZ造成Ⅰ型糖尿病的高血糖状态并最终引起晶体混浊而形成白内障。在光镜下，正常对照组晶状体上皮细胞呈单层排列，较为规律。而在糖性白内障组中，晶状体上皮细胞发生了斑片样聚集生长、形成复层结构的病理特征，并似梭形细胞至成纤维细胞样，与前囊膜下白内障和后囊膜混浊的病理特征相似。
近年来研究表明，TGF-β也可诱导晶状体上皮细胞产生斑片样多层生长并出现类似梭状的形态特点，甚至呈成纤维细胞样改变的病理变化，并在白内障发生过程中起重要作用。研究发现，TGF-β可引起大鼠晶体上皮细胞伸长、异常排列和增殖、胞外基质堆积增厚，囊膜皱缩 [3]。而在本实验中，我们发现正常大鼠的晶状体存在TGF-β1低水平的表达，而糖性白内障组中存在明显的表达，证实了TGF-β1在糖性白内障发病机制中的重要作用；TGF-β1随着病程的发展进行性表达增强，反应TGF-β1对于晶状体上皮发生斑片样状增生和梭形变化起着重要作用，符合糖性白内障发展的病理生理过程。
细胞外基质( extra cellular matrix,ECM)是机体内多种器官组织生存的细胞外骨架。细胞外基质由细胞合成分泌而来，它们对于内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等具有趋化作用，促进细胞在基质上的粘附，进而使细胞快速增殖。Nishi等有报道[4]，体外培养的白内障患者晶状体上皮细胞可以合成分泌Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ各型胶原。国内张晓红等[5]的结果表明，部分白内障患者晶状体囊中有Ⅰ型胶原的存在，可能来自其下面的晶状体上皮细胞。在本实验中，我们发现在正常晶状体上皮中不表达Ⅰ型胶原，而在糖性白内障组中出现Ⅰ型胶原的明显表达，且随着病程的发展进行性表达增强，表明Ⅰ型胶原在糖性白内障发病机制中的重要作用，Ⅰ型胶原是一种纤维性胶原，作为晶状体上皮细胞的细胞外骨架，它在细胞的移行、增殖、化生以及组织的疤痕化中起重要作用，因而可导致晶状体上皮发生斑片状多层聚集和梭形变化，白内障形成。
粘附分子是一类介导细胞间或细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白，它们在胚胎的发育分化、正常组织结构的维持、炎症与免疫应答、刨伤修复、肿瘤转移等多种生理病理过程中具有重要作用。晶状体上皮细胞能表达多种细胞粘附分子，如整联蛋白( integrin)、ICAM- 1、CD44等.通过这些细胞粘附分子，晶状体上皮细胞得以粘附在其下方的囊膜上，细胞粘附分子可能参与白内障术后晶状体上皮细胞移行至后囊膜过程中的细胞脱落与粘附[6]。ICAM-1是Rothlein等于1986年研究淋巴细胞黏附时发现的[7]，克隆号CD54，属免疫球蛋白超家族成员，是分子量为80～110KD的单链糖蛋白[8,9]，具有5个细胞外串联的单链免疫球蛋白样结构域和1个胞质尾样结构域。在体内ICAM-1有二种存在形式，一种为膜型，是一种细胞表面跨膜蛋白抗原。另一种是可溶型(sICAM-1)，它被认为是在一些因素作用下，由膜型ICAM-1从细胞表面脱落而形成，包括有膜型ICAM-1胞外区的D1D2D4D5的全部或大部分片段，存在于血循环中。Nishi等[6]用免疫组化染色测定人晶体上皮细胞的粘附分子的表达，白内障摘除术中做环形前囊膜切除后，将获取的前囊晶体上皮细胞进行培养2周，结果发现术后即取的和培养的晶体上皮细胞都表达ICAM-1、β1-整合素、CD44。当在细胞培养液中加入ICAM-1、β1-整合素、CD44的单克隆抗体（10mg/mL）后，晶体上皮细胞在前囊膜的胶原和层粘连蛋白基质上的增殖和移位受到明显的抑制。从该研究可以看出发生白内障的人晶体上皮细胞ICAM-1的表达增加。近年有研究表明，晶体上皮细胞和细胞外基质间的相互作用的改变和异常可引起细胞转化和基因表达异常，从而导致晶状体前、后囊膜下纤维化[10]。我们在实验中发现，ICAM-1在正常组晶状体上皮细胞中不表达，而糖性白内障组晶状体上皮细胞中ICAM-1存在明显的表达，且随着白内障病程的发展，ICAM-1的表达呈进行性增加。结合Nishi等的研究，我们可以推测ICAM-1不仅可以促进晶体上皮细胞在细胞外基质上生长和移行，而且促进了晶体上皮细胞与细胞外基质的粘附作用。因此推测ICAM-1是通过促进晶体上皮细胞的增殖、移行及改变晶体上皮细胞与细胞外基质的粘附状态的机制在白内障发生中发挥重要的作用。
在实验中，我们发现随着白内障的发生、发展过程的推移，晶状体混浊程度不断加深，晶体上皮细胞中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ表达明显增加，各时间段间的差异有显著性；而且TGF-β1 、ICAM-1和COL-Ⅰ的表达变化具有高度正相关。由此表明TGF-β1在糖尿病性白内障的发生过程中有一定调节作用，并且可以增加晶状体上皮细胞表达细胞外基质成分COL-Ⅰ和ICAM-1，推测TGF-β1诱导的细胞与ECM之间的相互作用是通过调节晶体上皮细胞中ICAM-1的转录活性而发挥作用的。ICAM-1的过量表达可由TGF-β1所诱导，并通过促进晶体上皮细胞与细胞外基质成分的粘附，改变晶体上皮细胞与细胞外基质的粘附状态，从而在晶状体上皮细胞发生移行、转分化和增殖中发挥起始作用，促进糖尿病性白内障的发生发展。
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