洛伐他汀对小鼠主动脉血管内皮生长因子表达的影响
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【摘要】目的：研究洛伐他汀（Lovastatin，LOV）对小鼠主动脉内皮生长因子（endothelial cell-derived growth factor， VEGF）表达的影响。方法：成年昆明小鼠24只，随机分为对照组、给药组（LOV低、高浓度）3组，每组8只小鼠。将1mg/ml的盐酸肾上腺素用0.9%生理盐水稀释1.5倍，于每日的8∶00 am、12∶00am、4∶00 pm对三组都予以皮下注射，盐酸肾上腺素0.05 ml/100 g，连续5天，建立内皮损伤模型。建模成功后，各組小鼠分别给予洛伐他汀（5、15mg/Kg）进行灌胃，对照组给予0.3ml生理盐水灌胃。六周后免疫组化检测小鼠主动脉VEGF的表达。结果：灌胃6周后，免疫组化显示，与对照组相比，给药组小鼠主动脉VEGF表达明显增强，且浓度越高，VEGF表达越强。结论：LOV通过促进VEGF的表达改善和治疗内皮损伤，LOV对小鼠主动脉内皮损伤后VEGF的表达具有促进作用。
【关键词】洛伐他汀 主动脉内皮损伤 血管 内皮生长因子
引言：内皮损伤被认为是血管壁内的动脉粥样硬化 （athero-
sclerosis， AS）发生发展的早期启动因素 。而洛伐他汀属于调整血脂药， 是临床上常用的降血脂、预防心脑血管疾病的药物。他汀类药物对血管内皮损伤也有明显的改善作用 。但是其机制尚不明确。本实验通过观察洛伐他汀对小鼠主动脉内皮损伤后VEGF表达的影响，初步探讨洛伐他汀可能的机制。
一、材料与方法
（一）药物试剂与仪器
成年昆明小鼠24只，雌雄各半，盐酸肾上腺素，戊巴比妥钠，VEGF免疫组化S-P试剂盒，HE染色试剂盒，洛伐他汀，生理盐水等
（二）动物分组及模型制备
随机选取16只小鼠作为给药组，8只作为对照组。将1 mg/ml的盐酸肾上腺素用0.9%生理盐水稀释1.5倍，三组小鼠均于每日的8∶00 am、12∶00am、4∶00 pm在皮下注射稀释后的盐酸肾上腺素0.05 ml/100 g，连续5天，自第4天起每二次给药中间时间将小鼠放入0℃的冰水中冰泳5 min，共4次。
（三）病理学标本制备
60℃烤片12h;切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5 min。再用蒸馏水浸洗5 min;苏木素染5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝;伊红染3～5min，蒸馏水冲洗;梯度酒精（95-100%）脱水，每级5 min（或者直接把片子烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片、显微镜观察。
（四）免疫组化检测VEGF的表达
60℃烤片12 h;切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5 min。再用蒸馏水浸洗5 min;热修复抗原：将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电，连续煮20min后，冷却10min后拿出，冷却至室温。冷却后0.01M PBS（pH7.2～7.6）洗涤3 min x 3次;加入1%高碘酸，室温20 分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次;孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（VEGF），4℃过夜。PBS冲洗5 min x 3次;孵育二抗：滴加50～100 μL抗-小鼠-IgG抗体-HRP多聚体37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min x 3次;DAB显色： 滴加预制好的显色剂DAB工作液50～100 μL，室温孵育1～5 min， 镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤;苏木素复染5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝;各级酒精（60-100%）脱水，每级5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片、显微镜观察。
二、结果
于第6天晨，分别任意抽取对照组、给药组各2只小鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉（4.5 mg/100 g），取主动脉HE染色观察。结果显示造模成功。造模成功后，将给药组的14只小鼠随机分为洛伐他汀低、高（5、15 mg /kg）两个剂量组。除通过灌胃灌进不同剂量的洛伐他汀外，其余条件皆与对照组相同。6周后测量大鼠主动脉VEGF的表达，结果显示与对照组（图A）相比，给药组（图B、C）VEGF表达明显增强，且与洛伐他汀低剂量组（图B）（5mg/kg）相比，洛伐他汀高剂量组（图C）（15mg/kg）表达更强。
三、讨论
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性、进行性、多因素的系统性疾病，是心脑血管疾病的病理基础。有文献指出，血管内皮损伤是动脉硬化的最初使动因素，动脉硬化患者早期的表现就是内皮损伤，内皮细胞功能不全。功能红曲有效成分洛伐他汀（Lovas-tatin）是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，具有降低胆固醇、调节血脂作用。
洛伐他汀除了具有显著的降血脂效果外，还能明显地改善内皮细胞的功能、抗炎和抗增殖，促进一氧化氮合成酶（eNOS）的产生，从而增加NO的合成和释放，这对血管内皮有着许多积极意义。多项研究指出， 他汀类药物在降低血脂及心血管事件中有良好的预防和治疗作用。另有研究表明他汀类药物对机体一些部位VEGF的表达有促进作用。VEGF是一种特异性较高的血管内皮生长因子，能影响内皮细胞的功能，在加重和形成AS方面发挥重要作用。但综合已知文献，目前对于他汀类药物预防和治疗机制的研究尚不是很明确。
本实验通过观察洛伐他汀对小鼠主动脉内皮损伤后VEGF表达的影响，初步探讨洛伐他汀可能的机制。免疫组化实验结果显示，与对照组相比给药组VEGF表达明显增强，且与洛伐他汀低剂量组（5mg/kg）相比，洛伐他汀高剂量组（15mg/kg）表达更强。综上所述，LOV通过促进VEGF的表达改善和治疗内皮损伤。LOV对小鼠主动脉内皮损伤后VEGF的表达具有促进作用。 本次实验的不足：由于经费有限，本次实验只设置了高低两个剂量组并未设置更多的剂量梯度，因此无法进行更加细致的比较。另外本次实验只是对造模第6天、灌胃6周的小鼠后进行HE染色取材观察，灌胃六周后的小鼠进行了免疫组化观察，因此只能了解始末的变化，无法细致的了解其中间的变化过程，下一步实验可以做与此相关的进一步研究或者他汀类药物对不同组织如睾丸，脑组织等损伤后VEGF表達的影响。
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基金项目：长沙医学院大学生研究性学习与创新性实验计划项目（长医教[2018]77号-252）。
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