天水大樱桃叶总黄酮体外抗氧化性能研究

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　　【摘要】通过超声辅助方法提取樱桃叶总黄酮并进行纯化，考察了大樱桃叶总黄酮的总抗氧化能力、清除超氧阴离子自由基能力、清除羟自由基能力，与抗氧化剂维生素C比较得出，大樱桃叶黄酮具有良好的抗氧化效果，清除羟自由基的能力优于维生素C，但清除超氧阴离子自由基和总体抗氧化能力低于维生素C。
　　【关键词】大樱桃叶  黄酮  抗氧化
　　本文探讨了超声辅助方法提取天水地区种植的大樱桃叶中黄酮类化合物的条件，并对大樱桃叶黄酮与常见的抗氧化剂维生素C的抗氧化性能做比较，为大樱桃叶黄酮在食品、保健品等领域的应用奠定了理论基础。
　　一、材料与方法
　　（一）仪器
　　紫外分光光度计;旋转蒸发器;恒温水浴锅;数控超声波清洗器;酒精计;电子天平;高速台式离心机;数显恒温水浴锅;电热恒温鼓风干燥箱。
　　（二）材料与试剂
　　大樱桃叶黄酮粗提物，由本研究的前期实验提供。芦丁对照品、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、双氧水、邻苯三酚、VC等均为国产分析纯。
　　（三）方法
　　（1）大樱桃叶总黄酮的提取及纯化。称取粉碎后大樱桃叶粉末50g 于三角瓶中，加入1L70%乙醇于70 ℃下进行提取，提取过程中进行超声提取，超声功率250W，超声时间60min，不断震摇。提取后真空抽滤，真空冻干得到粗提物粉末。经粗提后的大樱桃叶黄酮用65%的乙醇溶解后，经DM-101大孔树脂柱进行纯化，收集纯化液，真空旋蒸得到大樱桃叶总黄酮纯化物。加蒸馏水稀释至浓度为1.0mg/m L樱桃叶黄酮溶液的样品储备液。再配制1.0mg/m L的维生素C溶液的样品储备液。
　　（2）总抗氧化活性的测定一磷钼络合物法。将样品储备液用蒸馏水稀释得到浓度分另4为0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、和0.3mg/mL的大樱桃叶黄酮溶液、Vc溶液，作为样品液。磷钼试剂的终浓度为0.6mol/L浓硫酸，28 mmol/L磷酸钠和4mmol/L钼酸铵的溶液。在一系列10mL的比色管中加入0.4mL上述樣品液和4.0mL磷钼试剂，迅速摇匀后置于95℃水浴中，恒温90 min。在695nm波长下测吸光度A。平行测定3次，取其平均值。
　　（3）大樱桃叶黄酮纯化物对羟自由基清除率的测定。将大樱桃叶黄酮纯化物依次按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和1∶25 稀释，得到不同质量浓度的样品醇溶物。精确吸取3mL不同质量浓度（0.509、0.768、0.914、1.691、3.318 mg·L-1）样品醇溶物于试管中，依次向试管中加入2mL0.1mol·L-1FeSO4、2mL0.1mol·L-1水杨酸、2mL0.1mol·L-1H2O2，用蒸馏水定容至10mL并摇匀，在37 ℃条件下恒温加热30min后在510nm波长处测定其吸光度Aa;将体系中样品用3mL无水乙醇代替，在相同条件下测定其吸光度A0;将体系中H2O2用蒸馏水代替在相同条件下测定其吸光度Ab。
　　（4）大樱桃叶黄酮纯化物对超氧阴离子自由基清除率的测定。取5支10mL离心管各加入pH8.2的50mmol/LTris-HC1缓冲液4.5mL，再分别加入大樱桃叶黄酮纯化物的样品醇溶物0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，然后依次加蒸馏水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0mL，混匀后在25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25 ℃预热过的3mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL启动反应。5min后加10mol/L盐酸溶液0.2mL终止反应。同时另取5支离心管，按上述步骤依次加入Tris-HCl缓冲液、黄酮提取液和蒸馏水，然后分别加10 m mol/L盐酸溶液0.3 m L，5 min后加10 mol/L盐酸溶液0.2 m L终止反应，摇匀。在325 nm波长处检测吸光度。
　　二、结果与分析
　　（1）大樱桃叶黄酮纯化物总抗氧化活性分析。磷钼络合物法的测定原理是Mo（VI）被抗氧化物质还原生成绿色的Mo（V）络合物，其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。通过与抗氧化剂维生素C相比，大樱桃叶黄酮的抗氧化性总体比维生素C弱。
　　（2）大樱桃叶黄酮纯化物清除羟自由基能力分析。实验结果表明，大樱桃叶黄酮纯化物和VC清除羟自由基的能力与质量浓度呈上升趋势。在相同浓度下，大樱桃叶黄酮纯化物对羟自由基的清除效果优于 Vc，当大樱桃叶黄酮纯化物的浓度为35μg/mL 时，大樱桃叶黄酮纯化物对羟自由基的清除率达到87.5%。
　　（3）大樱桃叶黄酮纯化物清除超氧阴离子自由基能力分析。实验结果表明，大樱桃叶黄酮纯化物和VC清除羟自由基的能力与质量浓度呈上升趋势。如图 1所示，在相同浓度下，大樱桃叶黄酮纯化物清除超氧阴离子自由基能力低于维生素C当大樱桃叶黄酮纯化物的浓度为35 μg/mL 时，大樱桃叶黄酮纯化物对羟自由基的清除率达到71.2%。
　　三、结论
　　本文通过对大樱桃叶总黄酮的总抗氧化能力、清除超氧阴离子自由基能力、清除羟自由基（·OH）能力等方面的考察表明，大樱桃叶黄酮具有良好的抗氧化效果，清除·OH的能力优于维生素C，但清除超氧阴离子自由基和总体抗氧化能力略低于维生素C。因此，大樱桃叶黄酮类化合物是一种很好的抗氧化剂，可作为天然的抗衰老保健品、食品抗氧化剂和具有辅助疗效的药物添加剂使用，在天然抗氧化剂和医药保健相关领域具有广阔的开发前景。
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